PMC (Svenska)
diskussion
det är viktigt att relatera genvariationer till kliniska fenotyper med hjälp av lämpliga fenotypverktyg för CYP3A4-aktivitet. 3-hydroxyleringen av kinin hade bevisats som en biomarkörreaktion för CYP3A4-aktivitet eftersom 3-hydroxylering av kinin katalyseras av CYP3A4 både in vivo och in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Därför användes de kinetiska parametrarna för enzymatisk katalys på kinin 3-hydroxylering som ett mått på CYP3A4-aktivitet i den nuvarande studien.
tjugotre av de rekombinanta CYP3A4-holoenzymerna visade signifikant minskad Klint mot kinin. Sex varianter, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift), och CYP3A4*21 (Y319C), uppvisade mycket lägre CLint för kinin (1.44–5.80%, Tabell 2) än vild-typ CYP3A4*1A., Om våra in vitro-fynd replikeras i kliniska studier kan patienter som är bärare av dessa alleler vara potentiellt CYP3A4-fattiga metaboliserare och kan: i) kräva lägre kinindoser för att nå terapeutiska plasmakoncentrationer; och ii) ha ökad risk för biverkningar och toxicitet när konventionella doser av kinin används.
CYP3A4 * 2 (s222p) uppvisade en reducerad CLint på mer än sexfaldigt (14.76%, Tabell 2) för kinin jämfört med vildtyp CYP3A4*1A., Denna minskade enzymatiska aktivitet kan bero på att en serin→prolin aminosyrasubstitution kan orsaka en stor förändring i enzymets tredimensionella struktur (prolin är känd för att bryta alfa-helices). På samma sätt har CYP3A4*2 rapporterats ha en lägre CLint för midazolam (Miyazaki et al., 2008), nifedipin (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu m.fl., 2018), och lidokain (Fang et al., 2017), än för det vilda enzymet. Däremot visade CYP3A4*2 en högre CLint för amiodaron (Yang et al., 2019)., För testosteron hade CYP3A4*2 ett minskat internt clearance när det uttrycktes med Escherichia coli express system in vitro (Miyazaki et al., 2008), men aktiviteten var jämförbar med den vilda typ enzym när den uttrycks i baculovirus expression system (Sata et al.( Tabell 3).
CYP3A4 * 3 (M445T) visade lägre enzymatisk aktivitet mot kinin jämfört med vildtypsallelen (Tabell 2)., Aminosyrarester 445 ligger inom den konserverade heme-bindande regionen, bara två aminosyra-C-terminaler till de absolut konserverade Cysna vid position 442 i CYP3A4-proteinet (Sata et al., 2000); därför kan en Met445Thr-förändring utöva en ogynnsam effekt på heme-bindningen, vilket resulterar i en förändring i enzymets katalytiska aktivitet, speciellt vid bindning av ett lämpligt substrat. Men som framgår av Tabell 3 liknade den enzymatiska aktiviteten hos CYP3A4*3 den för de flesta undersökta substrat av vildtyp CYP3A4., Resultatskillnaden kan bero på olika heterologa uttrycksmetoder som används och på grund av olika substratspecificitet för varianten.
CYP3A4*4 (I118V) uppvisade lägre CLint mot kinin, i förhållande till wild-type CYP3A4*1A. Studier av webbplats riktad mutagenes tyder på att ser119 är en viktig aminosyra inblandad som en aktiv plats rester (Yano et al., 2004). Följaktligen kommer Ile118valmutationen sannolikt att påverka konformationen av det aktiva stället, vilket resulterar i minskad katalytisk aktivitet., På samma sätt visade en in vivo-studie att förhållandet mellan urinnivån av 6β-hydroxikortisol / fri kortisol i dessa heterozygota individer var lägre än i friska kontroller, vilket tyder på minskad enzymatisk aktivitet (Hsieh et al., 2001).
både CYP3A4*8 och *13 varianter visade detekterbara, om än lägre, nivåer av CYP3A4-holoproteiner och hade extremt låga katalytiska aktiviteter mot kinin. I motsats till våra resultat har CYP3A4*8 och *13 rapporterats uppvisa inga detekterbara CYP-holoproteiner när de uttrycks i bakteriesystem (Eiselt et al., 2001)., Vi spekulerar i att användningen av bakteriella vs insektsuttryck system kan förklara de olika resultaten. Bakterieuttryckssystemet saknar en intracellulär membranmiljö (Gonzalez och Korzekwa, 1995) som krävs för högt uttryck av protein. Däremot kan insektsceller bearbeta och modifiera proteiner på ett sätt som liknar mänskliga celler, vilket möjliggör korrekt vikning av enzymet och inkorporering av heme-kofaktorn, vilket resulterar i högre uttryck för CYP3A4-proteiner.,
CYP3A4 * 11 (T363M) uttrycktes vid signifikant lägre nivåer än vildtyp CYP3A4 (Figur 2), ett resultat som överensstämmer med studier med bakteriella eller däggdjursuttryck system (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). Treonin med resthalt 363 på substraty recognition site (SRS)-5 kan bidra till bildandet av vätgasbindningsnätverket. En substitution från treonin till metionin kan leda till förlust av katalytisk aktivitet (Murayama et al., 2002). Så CYP3A4 * 11 visade minskad kininhydroxyleringsaktivitet i nuvarande studie., Dessutom visade CYP3A4*11 minskad testosteronhydroxyleringsaktivitet (Murayama et al., 2002), hade anmärkningsvärt ökat CLint mot lidokain (Fang et al., 2017) och amiodaron (Yang et al., 2019), men var inte associerad med märkbara förändringar i metaboliska aktiviteter för ibrutinib (Xu et al., 2018) (Tabell 3).
CYP3A4 * 12 (L373F) visade en dramatiskt minskad CLint mot kinin, på samma sätt som ett tidigare forskningsresultat mot midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4 * 12 har en aminosyraförändring av Leu373Phe; den muterade återstoden ligger nära Arg-372 och Glu-374, som deltar i bildandet av ett vätebindningsnät och är involverade i aktiva platser enligt studier som involverar platsstyrd mutagenes (Yano et al., 2004). Mutationsresterna (L373F) kommer därför sannolikt att påverka stabiliteten i vätgasbindningsnätet och den rumsliga konformationen i det aktiva stället, vilket resulterar i förändrad katalytisk aktivitet hos CYP3A4*12.,
CYP3A4 * 20 (488 frameshift) visade anmärkningsvärt minskat apoproteinuttryck (Figur 1) och dramatiskt minskat CLint mot kinin. Däremot har inga katalytiska aktiviteter av midazolam 1′- och 4-hydroxylering rapporterats i jäst eller hek 293 mikrosomer som uttrycker CYP3A4 * 20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Dessa motstridiga resultat kan bero på de olika heterologa uttryckssystem och substrat som används i experimenten. Dessutom har en CYP3A4*20 heterozygot, identifierad hos brasilianska individer, rapporterats uppvisa minskat systemiskt clearance av 1.,9-vik för midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Det var hypoteser tidigare att denna sällsynta mutation kan påverka proteinvikning, heme-införlivande (Westlind-Johnsson et al., 2006), och den rumsliga konformationen av aktiv plats hålighet, vilket ger upphov till en minskning eller förlust av katalytisk aktivitet associerad med det använda substratet.
CYP3A4*21 (Y319C), som identifierades i Kinesiska befolkningen (Zhou et al., 2011), visade svag katalytisk aktivitet mot kinin i vår studie. Intressant nog identifierades inget detekterbart apoenzymuttryck i våra resultat., Tyr319 är en mycket bevarade rester i cytokrom P450-familjen hela eukaryota utvecklingen från nematod till människa (Zhou et al., 2011). Enligt i silico funktionella förutsägelser (Zhou et al., 2011), tyr319-rester ligger på en viktig domän och en substitution av Tyr med Cys vid position 319 av CYP3A4*21-proteinet kan inducera dramatiska förändringar i aktiv kavitetskonfiguration. Därför kan CYP3A4 * 21 producera ett funktionsfelsprotein med minskad katalytisk aktivitet mot kinin., Dessutom spekulerade vi att dessa antikroppar vi använde för att detektera CYP3A4 rekombinanta apoproteiner kanske inte är lämpliga för att detektera varianten CYP3A4 * 21. Det vill säga mutationen av Tyr319Cys i CYP3A4*21 kan förhindra att dessa antikroppar känner igen de specifika epitoperna i CYP3A4.
däremot visade två av de rekombinanta CYP3A4-holoenzymerna, CYP3A4*15 (R162Q) och CYP3A4*29 (F113I) signifikant ökad Klint för kinin. På samma sätt uppvisade både CYP3A4*15 och CYP3A4*29 ökad Klint mot lidokain (Fang et al., 2017), men visade minskade CLint för ibrutinib (Xu et al., 2018)., CYP3A4 * 15 upptäcktes först i olika etniska populationer med små prover för varje etnisk grupp (Lamba et al., 2002). CYP3A4*29 identifierades och namngavs i vår nyligen genomförda studie (hu et al., 2017). De två varianterna är relaterade till snabb metabolism av kinin in vitro. Om bekräftelse av ökat kininclearance finns hos individer som är homozygot eller heterozygot bärare av CYP3A4 * 29 eller CYP3A4 * 15, kan dessa individer vara CYP3A4 ultra-snabba metaboliserare av kinin., Patienter med dessa genotyper kan: i) Ha sämre terapeutisk effekt när vanliga kliniska doser av kinin administreras; och ii) kräva högre doser för att nå terapeutiska plasmakoncentrationer.
inga aktiva holoenzymer av CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop) och CYP3A4*30 (r130stop) varianter detekterades och följaktligen uppvisade de ingen metabolisk aktivitet vid kinin (Tabell 2).,
CYP3A4 * 6 har en infogning av en adeninrester i exon 9( 830-831 insA); denna mutation orsakar en frameshift och leder till översättning av ett stympat protein som inte kan innehålla heme (Hsieh et al., 2001). Följaktligen identifierades inte den katalytiska aktiviteten av CYP3A4*6 mot kinin i vår studie. Som tidigare visats in vivo visade sig en kinesisk person vara heterozygot för CYP3A4*6 med ett mycket lägre förhållande mellan urinhalten 6β-hydroxikortisol: fri kortisol än vilda individer, vilket tyder på minskad CYP3A4-aktivitet (Hsieh et al., 2001)., På samma sätt hade en patient som är heterozygot för CYP3A4*6, som genomgår organtransplantation, ett takrolimuskoncentration-till-justerat dosförhållande som var 4, 3 gånger högre än för vilda patienter (Jun et al., 2009).
CYP3A4*26 har en C – →T nukleotid substitution i exon 5. Detta orsakar en förändring från arginin till en för tidig stoppkodon vid position 268, och resulterar i ett förmodat förkortat protein som saknar katalytisk domän och därför aktivitet (Werk et al., 2014)., CYP3A4*26 kanske inte uttrycks på grund av den för tidiga stoppkodon vid position 268 eller om det är, kan proteinet märkas för snabb nedbrytning (Werk et al., 2014). Följaktligen kunde vi inte detektera holoproteinet av CYP3A4 * 26-varianten uttryckt i Sf21-celler. På samma sätt uppvisade en 19-årig njurtransplanterad patient, identifierad som en homozygot för CYP3A4*26 och samtidigt också en homozygot för CYP3A5*3, en oväntat hög plasmanivå av takrolimus som ett resultat av extremt minskat takrolimusclearance (Werk et al., 2014).,
I likhet med CYP3A4*26 har CYP3A4*30 en förändring från arginin till en för tidig stoppkodon vid position 130 (hu et al., 2017). Arg130 anses vara viktigt för heme-införlivande (Eiselt et al., 2001) och därmed mutation av Arg130 skulle störa heme inkorporering och därmed påverka holoenzymuttryck av CYP3A4.
i kombination med tidigare studier (tabell 3) visade vissa CYP3A4-alleliska varianter de olika preferenserna för substraten, till skillnad från de för Wild-typenzymerna. Namnlösa: vissa varianter uppvisar förändrade katalytiska aktiviteter med en substratberoende profil., Som diskuterats ovan kan motstridiga resultat som härrör från ett specifikt substrat i studier uppstå av många faktorer, såsom avvikelser från in vitro-eller in vivo-metoden och olika heterologa uttryckssystem.
kinin har frekventa biverkningar, på grund av dess smala terapeutiska index (Bateman och Dyson, 1986). Dessa biverkningar inducerades inte bara av droger; de orsakades också av vanliga kininhaltiga drycker., Baserat på en systematisk genomgång av kliniska data från hundra-fjorton artiklar, biverkningar, som var resultatet av kinininnehållande drycker, stod för 20% av de totala biverkningarna mot kinin (Liles et al., 2016). Överraskande, även med minutexponering från vanliga drycker, upplevde vissa individer allvarliga biverkningar som involverade flera organsystem. Med tanke på den uppenbara interindividuella mångfalden i kininkänsligheten kan variation i CYP3A4 vara en möjlig mekanism som ligger till grund för kininkänsliga och negativa effekter., Dessutom har regler för kininanvändning inte fastställts i vissa länder, såsom piller som innehåller 50 mg eller mindre av kinin betraktas som en naturlig hälsoprodukt och finns utan recept i Kanada (Liles et al., 2016); kinininnehållande lotioner och schampon, liksom kinininnehållande drycker, förblir allmänt tillgängliga och övervakning krävs inte. Således antas ökad medvetenhet om interindividuella skillnader i kininkänslighet och biverkningar mot kinin bland läkare och allmänheten vara nödvändiga.