PMC (Français)
Discussion
Il est important de relier les variations géniques aux phénotypes cliniques à l’aide d’outils de phénotypage appropriés de L’activité du CYP3A4. La 3-hydroxylation de la quinine a été prouvée comme une réaction de biomarqueur pour L’activité du CYP3A4 parce que la 3-hydroxylation de la quinine est catalysée par le CYP3A4 à la fois in vivo et in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et coll., 2011)., Par conséquent, les paramètres cinétiques de la catalyse enzymatique sur la quinine 3-hydroxylation ont été utilisés comme mesure de L’activité du CYP3A4 dans la présente étude.
vingt-trois des holoenzymes recombinantes du CYP3A4 ont montré une diminution significative de la CLint vers la quinine. Six variantes, le CYP3A4*8 (R130Q), le CYP3A4*12 (L373F), le CYP3A4*13 (P416L), le CYP3A4*17 (F189S), le CYP3A4*20 (488 frameshift) et le CYP3A4*21 (Y319C), présentaient un taux de CLint beaucoup plus faible pour la quinine (1,44–5,80%, Tableau 2) que le CYP3A4*de type sauvage 1 bis., Si nos résultats in vitro sont reproduits dans les études cliniques, les patients porteurs de ces allèles peuvent être potentiellement des métaboliseurs pauvres du CYP3A4 et peuvent: i) avoir besoin de doses plus faibles de quinine pour atteindre les concentrations plasmatiques thérapeutiques; et ii) être plus à risque d’effets indésirables et de toxicité lorsque des doses conventionnelles de quinine sont utilisées.
le CYP3A4*2 (S222P) a présenté une réduction de CLint de plus de six fois (14,76%, Tableau 2) pour la quinine par rapport au CYP3A4*1a de type sauvage., Cette diminution de l’activité enzymatique pourrait être due au fait qu’une substitution d’acides aminés sérine→proline pourrait provoquer un changement majeur dans la structure tridimensionnelle de l’enzyme (la proline est connue pour casser les hélices alpha). De même, le CYP3A4 * 2 a été rapporté pour posséder un CLint inférieur pour le midazolam (Miyazaki et al., 2008), la nifédipine (Sata et coll., 2000; Miyazaki et coll., 2008), ibrutinib (Xu et coll., 2018) et la lidocaïne (Fang et coll. En 2017), que celle de l’enzyme de type sauvage. En revanche, le CYP3A4 * 2 a montré un CLint plus élevé pour l’amiodarone (Yang et al., 2019)., Pour la testostérone, le CYP3A4*2 avait une clairance intrinsèque diminuée lorsqu’il était exprimé à L’aide du système express D’Escherichia coli in vitro (Miyazaki et al., 2008), mais l’activité était comparable à celle de l’enzyme de type sauvage lorsqu’elle était exprimée dans le système d’expression du baculovirus (Sata et al., 2000) (Tableau 3).
le CYP3A4*3 (M445T) a montré une activité enzymatique plus faible vis-à-vis de la quinine, comparativement à l’allèle de type sauvage (Tableau 2)., Le résidu d’acide aminé 445 est situé dans la région de liaison à l’hème conservée, à seulement deux bornes C d’acide aminé aux Cys absolument conservés à la position 442 dans la protéine CYP3A4 (Sata et al., 2000); par conséquent, un changement Met445Thr peut exercer un effet défavorable sur la liaison de l’hème, entraînant une altération de l’activité catalytique de l’enzyme, en particulier lors de la liaison d’un substrat approprié. Mais comme indiqué dans le tableau 3, l’activité enzymatique du CYP3A4*3 était similaire à celle du CYP3A4 de type sauvage pour la plupart des substrats testés., La divergence des résultats pourrait provenir de différentes méthodes d’expression hétérologue utilisées, et en raison de la spécificité différente du substrat pour la variante.
le CYP3A4*4 (I118V) présentait une CLint plus faible vis-à-vis de la quinine, par rapport au CYP3A4*1A de type sauvage. les études de mutagenèse dirigée par site suggèrent que le ser119 est un acide aminé clé impliqué comme résidu de site actif (Yano et al., 2004). Par conséquent, la mutation Ile118Val est susceptible d’affecter la conformation du site actif, entraînant une diminution de l’activité catalytique., De même, une étude in vivo a montré que le rapport du taux urinaire de 6β-hydroxycortisol/cortisol libre chez ces individus hétérozygotes était inférieur à celui des témoins sains, suggérant une diminution des activités enzymatiques (Hsieh et al., 2001).
Les deux variantes du CYP3A4*8 et *13 présentaient des niveaux détectables, quoique plus faibles, d’holoprotéines du CYP3A4 et avaient des activités catalytiques extrêmement faibles envers la quinine. Contrairement à nos résultats, il a été rapporté que les CYP3A4*8 et *13 ne présentaient pas d’holoprotéines CYP détectables lorsqu’elles étaient exprimées dans des systèmes bactériens (Eiselt et al., 2001)., Nous supposons que l’utilisation de systèmes d’expression bactériens par rapport aux insectes peut expliquer les résultats différents. Le système d’expression bactérienne n’a pas d’environnement membranaire intracellulaire (Gonzalez et Korzekwa, 1995) requis pour une expression élevée des protéines. En revanche, les cellules d’insectes peuvent traiter et modifier les protéines d’une manière similaire aux cellules humaines, ce qui permet un pliage approprié de l’enzyme et l’incorporation du cofacteur hémique, ce qui entraîne une expression plus élevée des protéines CYP3A4.,
le CYP3A4*11 (T363M) a été exprimé à des niveaux significativement plus faibles que le CYP3A4 de type sauvage (Figure 2), une constatation qui concorde avec les études utilisant des systèmes d’expression bactériens ou mammifères (Eiselt et al., 2001; Murayama et coll., 2002). La thréonine au niveau du résidu 363 dans le site de reconnaissance du substrat (SRS)-5 peut contribuer à la formation du réseau de liaison hydrogène. Une substitution de la thréonine à la méthionine pourrait entraîner une perte d’activité catalytique (Murayama et al., 2002). Ainsi, le CYP3A4 * 11 a montré une activité réduite d’hydroxylation de la quinine dans l’étude actuelle., De plus, le CYP3A4 * 11 a montré une activité réduite d’hydroxylation de la testostérone (Murayama et al., 2002), avait remarquablement augmenté CLint vers lidocaine(Fang et al. En 2017) et l’amiodarone (Yang et coll., 2019), mais n’a pas été associée à des changements notables dans les activités métaboliques de l’ibrutinib (Xu et al., 2018) (Tableau 3).
le CYP3A4*12 (L373F) a montré une diminution spectaculaire de la CLint vers la quinine, de même qu’un résultat de recherche précédent vers le midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4 * 12 possède un changement d’acide aminé de Leu373Phe; le résidu muté est situé près D’Arg-372 et de Glu-374, qui participent à la formation d’un réseau de liaison hydrogène et sont impliqués dans des sites actifs selon des études impliquant une mutagenèse dirigée par site (Yano et al., 2004). Par conséquent, le résidu mutationnel (L373F) est susceptible d’affecter la stabilité du réseau de liaison hydrogène et la conformation spatiale de la cavité du site actif, entraînant une altération de l’activité catalytique du CYP3A4*12.,
le CYP3A4*20 (488 frameshift) a montré une diminution remarquable de l’expression des apoprotéines (Figure 1) et une diminution spectaculaire de la CLint vers la quinine. En revanche, aucune activité catalytique de l’hydroxylation 1′ et 4 du midazolam n’a été rapportée dans des microsomes de levure ou de HEK 293 exprimant le CYP3A4 * 20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Ces résultats contradictoires peuvent être attribuables aux différents systèmes d’expression hétérologues et substrats utilisés dans les expériences. En outre, un hétérozygote CYP3A4 * 20, identifié chez des individus Brésiliens, a été signalé comme présentant une clairance systémique réduite de ∼1.,9 fois pour le midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). On a émis l’hypothèse que cette mutation rare pourrait influencer le repliement des protéines, l’incorporation de l’hème (Westlind-Johnsson et al., 2006), et la conformation spatiale de la cavité du site actif, entraînant une diminution ou une perte d’activité catalytique associée au substrat utilisé.
CYP3A4*21 (Y319C), qui a été identifié dans la population chinoise (Zhou et al., 2011), ont montré une faible activité catalytique envers la quinine dans notre étude. Fait intéressant, aucune expression d’apoenzyme détectable n’a été identifiée dans nos résultats., Tyr319 est un résidu hautement conservé dans la famille du cytochrome P450 tout au long de l’évolution des eucaryotes, du nématode à l’humain (Zhou et al., 2011). Selon les prédictions fonctionnelles in silico (Zhou et al., 2011), le résidu Tyr319 se trouve sur un domaine important et une substitution de Tyr par Cys à la position 319 de la protéine CYP3A4*21 peut induire des altérations dramatiques dans la configuration de la cavité du site actif. Par conséquent, le CYP3A4*21 peut produire une protéine dysfonctionnelle avec une activité catalytique réduite vers la quinine., De plus, nous avons émis l’hypothèse que ces anticorps que nous avons utilisés pour détecter les apoprotéines recombinantes du CYP3A4 pourraient ne pas convenir pour détecter le variant CYP3A4*21. Autrement dit, la mutation de Tyr319Cys dans le CYP3A4*21 peut empêcher ces anticorps de reconnaître les épitopes spécifiques du CYP3A4.
en revanche, deux des holoenzymes recombinantes du CYP3A4, CYP3A4*15 (R162Q) et CYP3A4*29 (F113I), ont montré une augmentation significative de CLint pour la quinine. De même, le CYP3A4*15 et le CYP3A4*29 ont montré une augmentation de la CLint vers la lidocaïne (Fang et al., 2017), mais a montré une diminution de CLint pour l’ibrutinib (Xu et al., 2018)., Le CYP3A4 * 15 a été détecté en premier dans différentes populations ethniques avec de petits échantillons pour chaque groupe ethnique (Lamba et al., 2002). CYP3A4*29 a été identifié et nommé dans notre étude récente (Hu et al., 2017). Les deux variantes sont liées au métabolisme rapide de la quinine in vitro. Si la confirmation de l’augmentation de la clairance de la quinine est trouvée chez les individus homozygotes ou hétérozygotes porteurs du CYP3A4*29 ou du CYP3A4*15, ces individus peuvent être des métaboliseurs ultra-rapides du CYP3A4 de la quinine., Les Patients avec ces génotypes peuvent: i) avoir une efficacité thérapeutique plus faible lorsque les doses cliniques habituelles de quinine sont administrées; et ii) avoir besoin de doses plus élevées pour atteindre les concentrations plasmatiques thérapeutiques.
aucune holoenzyme active des variants CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop) et CYP3A4*30 (R130Stop) n’a été détectée et, par conséquent, elle n’a montré aucune activité métabolique sur la quinine (Tableau 2).,
CYP3A4*6 a une insertion d’un résidu d’adénine dans l’exon 9 (830-831 insA); cette mutation provoque un frameshift et conduit à la traduction d’une protéine tronquée qui ne peut pas incorporer l’hème (Hsieh et al., 2001). Par conséquent, l’activité catalytique du CYP3A4*6 envers la quinine n’a pas été identifiée dans notre étude. Comme indiqué précédemment in vivo, une personne chinoise s’est avérée hétérozygote pour le CYP3A4 * 6 avec un rapport beaucoup plus faible du taux urinaire de 6β-hydroxycortisol:cortisol libre que les individus de type sauvage, suggérant une diminution de L’activité du CYP3A4 (Hsieh et al., 2001)., De même, un patient hétérozygote pour le CYP3A4 * 6, subissant une transplantation d’organe, avait un rapport concentration-dose ajustée de tacrolimus 4,3 fois plus élevé que celui des patients de type sauvage (Jun et al., 2009).
le CYP3A4*26 présente une substitution nucléotidique C→T dans l’exon 5. Cela provoque un changement de l’arginine à un codon d’arrêt prématuré à la position 268, et se traduit par une protéine raccourcie putative manquant de domaine catalytique et donc d’activité (Werk et al., 2014)., CYP3A4*26 peut ne pas être exprimé en raison du codon d’arrêt prématuré à la position 268 ou si c’est le cas, la protéine peut être marquée pour une dégradation rapide (Werk et al., 2014). En conséquence, nous n’avons pas pu détecter l’holoprotéine de la variante CYP3A4*26 exprimée dans les cellules Sf21. De même, un patient greffé d’un rein de 19 ans, identifié comme un homozygote pour le CYP3A4 * 26 et également un homozygote pour le CYP3A5*3, a présenté un taux plasmatique de tacrolimus étonnamment élevé en raison d’une clairance du tacrolimus extrêmement réduite (Werk et al., 2014).,
semblable au CYP3A4 * 26, le CYP3A4*30 passe de l’arginine à un codon d’arrêt prématuré à la position 130 (Hu et al., 2017). L’Arg130 est considéré comme important pour l’incorporation de l’hème (Eiselt et al., 2001) et donc la mutation de L’Arg130 perturberait l’incorporation de l’hème et affecterait ainsi l’expression de L’holoenzyme du CYP3A4.
en combinaison avec des études antérieures (Tableau 3), certaines variantes alléliques du CYP3A4 ont montré des préférences différentes pour les substrats, contrairement à celles des enzymes de type sauvage. À savoir, certaines variantes présentent des activités catalytiques altérées avec un profil dépendant du substrat., Comme indiqué ci-dessus, les résultats contradictoires provenant d’un substrat spécifique dans les études peuvent provenir de nombreux facteurs tels que les divergences de la méthode in vitro ou in vivo et différents systèmes d’expression hétérologues.
la Quinine a des effets indésirables fréquents, en raison de son indice thérapeutique étroit (Bateman et Dyson, 1986). Ces effets indésirables n’étaient pas seulement induits par des médicaments; ils étaient également causés par des boissons courantes contenant de la quinine., Sur la base d’un examen systématique des données cliniques de cent quatorze articles, les effets indésirables, qui ont été causés par des boissons contenant de la quinine, représentaient 20% du total des effets indésirables à la quinine (Liles et al., 2016). Étonnamment, même avec une exposition infime de boissons courantes, certaines personnes ont présenté des effets indésirables graves impliquant plusieurs systèmes d’organes. Étant donné la diversité inter-individuelle évidente de la sensibilité à la quinine, la variation du CYP3A4 peut être un mécanisme possible sous-jacent à la sensibilité à la quinine et aux effets indésirables., En outre, la réglementation relative à l’utilisation de la quinine n’a pas été établie dans certains pays, par exemple, les pilules contenant 50 mg ou moins de quinine sont considérées comme un produit de santé naturel et sont disponibles sans ordonnance au Canada (Liles et coll., 2016); Les lotions et shampooings contenant de la quinine, ainsi que les boissons contenant de la quinine, restent couramment disponibles et aucune surveillance n’est requise. Par conséquent, il serait nécessaire de sensibiliser davantage les médecins et le public aux différences inter-individuelles de sensibilité à la quinine et aux effets indésirables à la quinine.