Anti-mitokondrie-autoantistoffer i systemisk lupus erythematosus og deres association med sygdommens manifestationer
Undersøgelse godkendelse
patientpopulation
Det humane sera, der blev testet i denne undersøgelse blev indhentet fra University Health Network research ethics bestyrelsen (REB) godkendt undersøgelse af SLE-og APS patienter i Toronto samt fra raske kontrolpersoner, og PBC patienter rekrutteret fra CHU de Québec – Université Laval REB, der er godkendt undersøgelser i Quebec City., SLE-patienter skulle opfylde 1982 ACR-klassificeringskriterierne for SLE revideret i 199781,82 og APS-patienter opfyldte 1999 Sapporo-kriterierne for APS revideret i 200683,84. For SLE, træk kvindelige patienter fra University of Toronto Lupus Klinik (UTLC) blev kontaktet, og givet samtykke mellem August 2010 og oktober 2011 til at være en del af en undersøgelse om betydningen af fedtsyrer og hjerte-kar-sygdom, lupus. De leverede en blodprøve og havde deres anonymiserede kliniske data knyttet til deres biospecimen., Tilsvarende blev APS-patienter, der blev set på rheumatology clinic i Toronto, kontaktet efter en lignende procedure. Alle resterende biospecimen kunne bruges til fremtidige undersøgelser af biomarkører af lupus i henhold til de oprindelige forsøgspersoners samtykke. Raske kontrolfrivillige blev rekrutteret som en del af undersøgelsen af markører for betændelse, hvis de ikke havde nogen kendte sygdomme og ikke havde infektiøse symptomer på tidspunktet for blodtrækningen. Alder og køn blev samlet på det tidspunkt. PBC-patienter opfyldte PBC-klassificeringskriterierne for 2009, revideret i 201838,85 inklusive positiviteten for anti-mitokondrielle antistoffer.,
Data fra kliniske laboratorier
For SLE-patienter, anti-dsDNA blev målt ved hjælp af Farr-analysen (laboratorie-cut-off på 30%) og anti-cardiolipin (IgG og IgM – laboratorium cut-offs af 40 GPL eller MPL-enheder) blev målt ved hjælp af ELISA i et klinisk laboratorium.
cellekultur
inducerbar musemodel af SLE
henstillinger fra Det Canadiske Råd for dyrepleje blev fulgt i en protokol godkendt af Dyrevelfærdsudvalget ved Universit.Laval., C57BL / 6 J blev opnået fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) og huse i en Elite-Plus specifik patogen-fri dyr facilitet på CHU de .uebec. SLE autoantistoffer blev induceret i disse mus som tidligere beskrevet63. Kort sagt er 6-8 uger gamle mand mus modtaget 100 µL jeg.v. injektioner af ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, amerikas forenede stater), der blev fulgt på i 24 timer senere af en 100 µL jeg.v. injektion af lipopolysaccharide (LPS fra E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Disse injektioner blev gentaget efter 2 og 4 uger i i alt tre runder immuniseringer, og mus blev afblødt 48 timer efter den tredje immunisering. C57BL / 6 J mus injiceret i. v. med PBS under samme skema blev brugt som kontroller.
etik
gennem hele undersøgelsen blev blodprøver opnået fra patienter under informeret samtykke. Alle de metoder, der blev præsenteret i denne undersøgelse, blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og regler for både menneskelige og murine donorer.,
Mitokondrierisolering
mitokondrier blev isoleret fra leverene af C57BL / 6 J-mus efter en kombination af offentliggjorte protokoller61,62. Mus blev ofret ved cervikal dislokation, leveren blev hurtigt fjernet, galdeblæren udskåret, og leveren blev skyllet i iskold PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Leveren derefter blev hakket og overføres til en pre-afkølet glas/Teflon-væv, grinder, der indeholder 12 mL af is-koldt mitokondrie-isolation buffer (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM saccharose) per gram af leveren derefter jorden, indtil en homogen suspension blev opnået. Intakte celler og kerner blev pelleteret to gange ved 700 g, 4.C, 10 min. Kontaminerende membraner, proteiner og organeller blev elimineret ved to centrifugeringer ved 7.000 g, 4.C, 10 min efterfulgt af en centrifugering ved 10.000 g, 4. C, 10 min., Den rå mitokondrie-suspension blev yderligere oprenset ved ultracentrifugation mod en Percoll gradient (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v:v Percoll) på 95,000 g, 4 °C, 30 min. Båndet indeholdende mitokondrier blev opsamlet i PBS. En lignende fremgangsmåde blev anvendt til at isolere humane mitokondrier med den undtagelse, at op til 107 hep-G2-celler blev lyseret ved gentagne passager gennem en smalmålernål., Den kommercielle kit QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Tyskland) blev også brugt, efter fabrikantens anvisninger, for at isolere mitokondrier fra Hep-G2 celler for kvalitet sammenligning af western blotting med ovennævnte protokol. Isolerede mitokondrier blev doseret ved bicinchoninsyre (BCA) metode under anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher scientific, .altham, MA, USA). Frisk isolerede mitokondrier blev anvendt i alle forsøg med undtagelse af submitochondrialpartiklerpræparaterne, for hvilke pelleterede mitokondrier blev holdt ved -80.C, indtil det var nødvendigt.,
Submitochondrial particles (SMP) preparation
SMP blev fremstillet som beskrevet andetsteds ende60. Kortvarigt blev frosne mitokondrier optøet ved stuetemperatur og fortyndet til 10 mg mitokondrielle proteiner i 10 mM 4-Morpholinpropansulfonsyre (Mopper). Prøverne blev derefter sonicated ved hjælp af en Fisher Sonic Dismembrator Model 500 (Thermo Scientific) på 20% maksimal kapacitet for 20 sekunder, så holdt på et salt-ice i vandbad i 10 minutter. Denne cyklus blev gentaget ni gange., Prøverne blev derefter centrifugeret ved 16.000 g, 4 C C, 10 minutter for at kassere ubrudte mitokondrier og andet uønsket affald. Supernatanter blev opsamlet i et frisk rør og deres volumener justeret til 2 mL i 10 mM Mopper. Prøverne blev derefter ultracentrifugeret ved 150.000 g, 4.C i 45 minutter. Pelleteret SMP blev resuspenderet i SMP-buffer (225 mM mannitol, 75 mM saccharose, 10 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7.4) og doseres. SMP-præparater blev holdt ved -80.C, indtil det var nødvendigt.,
Røde blodlegemer mikropartikler (RBCMP) forberedelse
Røde blodlegemer (RBC), der var isoleret fra blod fra raske frivillige forsøgspersoner ved centrifugering på 282 g i 10 minutter ved RT. Platelet-rich plasma og buffy coat blev kasseret, og RBC brøkdel holdt. RBC var tælles (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) og justeret til en koncentration på 5 x 108 celler/mL i Tyrode ‘ s buffer (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4)., 109 celler blev derefter fortyndet i 45 mL dobbeltdestilleret vand og inkuberet i 5 minutter. Bufferens tonicitet blev derefter afbalanceret ved tilsætning af 5 ml PBS 10. (filtreret gennem en 0,22-µm membran). Rest RBC blev fjernet ved centrifugering 1.300 g i 5 minutter ved RT og supernatanten blev centrifugated på 18.000 g til 90 minutter ved 18 °C. RBC microparticle pellet blev derefter ophængt i 500 µl PBS. Proteinkoncentrationen blev målt med BCA-assay.,
Western blotting
Mitokondrie-størrelse måling af dynamisk lysspredning (DLS)
størrelsen af den isolerede mitokondrier blev målt ved DLS, ved hjælp af en Zetasizer Nano ZS enhed (Malvern instrumenter, Malvern, STORBRITANNIEN) og er forsynet med standard 4 mW, 633 nm he-Ne laser som lyskilde, som ligger på en afsløring vinkel på 173°. Forsøg blev replikeret tre gange i 1 cm lange engangs UV-Cuvetter (Brand GMBH, .ertheim, Tyskland) indeholdende 100 µL isolerede murine mitokondrier fortyndet i PBS i en koncentration på 10 proteinsg proteiner/µL., Følgende parametre blev taget i betragtning ved måling af størrelsen af den mitokondrielle: brydning indeks af opløsningsmiddel: 1.330, viskositet af prøven: 0.8872 mPas, brydning indeks af proteiner: 1.45, temperatur: 25 °C.
Elektron mikroskopi
Mitokondrier (108) var fast i 3,5% acrolein i 15 min ved stuetemperatur. Faste prøver blev skyllet to gange i PBS og derefter indlejret i 4% agarose. 50 um sektioner blev skåret under anvendelse af et vibratom, post-fikseret i 1% osmiumtetro .id i 30 minutter og indlejret i Durcupanharpiks., Halvfjerds nanometer ultratynde sektioner blev visualiseret ved 80 kV Ved hjælp af et tecnai G2 Spirit Biot .in (Fei, Hillsboro, OR, USA) transmissionselektronmikroskop.
Vurdering af den mitokondrielle ilt forbrug
Mitokondrier blev resuspenderet i mitokondrie-testopløsningen (MAS: 70 mM saccharose, 220 mM mannitol, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA og 0,2%(w/v) fedtsyre-gratis BSA, pH 7.4 ved 37 °C) og suppleret med 10 mM pyruvat, 2 mM malate og 4 µM FCCP , pH 7.4. En ækvivalent på 10 µg proteiner blev podet på platesf-96 plader (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Plader blev derefter centrifugeret 2.000 g i 20 minutter ved 4 C. C. Vi visualiserede fordelingen af mitokondrier under et lysfeltmikroskop for at sikre vedhæftning og homogen fordeling. Pladerne blev holdt ved 37.C uden CO2 i cirka 40 minutter før påfyldning. Iltforbruget priser (OCR), blev målt i overensstemmelse med producentens anvisninger (Agilent/Seahorse Bioscience). Eksperimenter blev gentaget i tre brønde og gennemsnit for hver eksperimentel tilstand., I alt 3 målinger af ilt forbrug for hver tilstand, der blev foretaget cirka hver 6 minutter under basale betingelser og efter sekventiel ud af rotenon (2 µM), tocopherolsuccinat hidrørende (10 mM), antimycin En (40 µM) og TMPD (N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine)/Ascorbat (100 µM/10 mM). Tocopherolsuccinat hidrørende blev brugt som elektron donor for komplekse II, rotenon som et komplekst jeg inhibitor, antimycin En som en kompleks III-hæmmer og respiration gennem komplekse IV blev målt ved hjælp af TMPD/ascorbat.,
Høj følsomhed flowcytometri
på Grund af deres lille størrelse, mitokondrierne var blevet opdaget ved høj følsomhed flowcytometri, ved hjælp af en “lille partikel option”, der består af en forward scatter (FSC), der er koblet til en photomultiplier rør (PMT), der er monteret på en BD FACS Canto II Særlig Henblik på Forskning Produkt (SORP, BD Biosciences). Mitokondrier (0.5 mg) blev farvet med 1 µg anti-TOMM22-Atto 488 (klon IC9-2, Sigma-Aldrich) og 1 µM af mitotracker dyb rød (Invitrogen, Carlsbad, CA, amerikas forenede stater) i 30 minutter ved 37 °C og fortyndet med PBS til en endelig volumen på 500 µl før flowcytometrisk analyse., For kvantitativt at måle antallet af mitokondrier brugte vi 3 µm diameter polystyren mikrosfære (Polysciences, PA, USA). 80.000 mikrosfærer blev tilsat til hver prøve, og 500 mikrosfærer blev erhvervet. Silica partikler (Kisker Biotech, Steinfurt, Tyskland) blev brugt til at bestemme 100-1.000 nm størrelse skala.
Mitokondrie-DNA ekstraktion af alkalisk lysis
Isolerede mitokondrier var pelleteret på 10.000 g, 4 °C, 10 min og resuspenderet i 0,8 mL mtDNA isolation En buffer for hver 3 mg af mitokondrie-proteiner., Mitokondrier blev derefter lyzeded i et volumen (v: v) mtDNA isolation buffer B (E .temporaneously-forberedt. 0.2 M NaOH, 1% SDS) i 3 min. på is, under blid agitation. mtDNA-suspensioner blev neutraliseret med et volumen (v: v) mtDNA-isolationsbuffer C (1,32 M kaliumacetat, pH 4,8 justeret med iskold eddikesyre) i 5 minutter. på is, under blid agitation. Mitokondrialt affald blev pelleteret ved centrifugering i 10 minutter ved 14.000 g, RT. supernatanter blev overført til friske rør. mtDNA blev udfældet natten over ved -20 C C med 0.,1 volumen (v:v) kaliumacetat (stamopløsning: 3 M natriumacetat, pH justeret til 5,2 med iskold eddikesyre) og 0,7 volumen (V:v) absolut isopropanol. mtDNA blev derefter pelleteret på 14,000 g, vasket tre gange med 1,5 mL 70% ethanol, og resuspenderet i DNA resuspension buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). Mitokondriel DNA-koncentration blev bestemt ved spektrofotometri (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
Kerneisolering fra musehepatocytter
kerner blev isoleret fra muselever ved anvendelse af offentliggjorte metoder86., Under mitokondrierisoleringsprotokoller, mens supernatanter blev anvendt til udførelse af mitokondrierisolationer, blev pellets fra den første 700 g centrifugering resuspenderet i 10 mL iskold kerneisolationsbuffer a (5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 mM saccharose. pH 7,4) og formalet i en forkølet glas/Teflon-vævskværn. Suspensionen blev yderligere afbrudt af tre passager gennem en 25 G5 / 8 gauge nål efterfulgt af to passager gennem en 27 G.gauge nål., Suspensionen blev derefter filtreret mod en 40 µM nyloncellesi (Thermo Fisher Scientific) og centrifugeret ved 600 g, 4.C, 10 min. Pellets blev resuspenderet i 14 mL buffer A og centrifugeret ved 600 g, 4.C, 10 min. Pellets blev derefter resuspenderet i 9 volumener iskold kerneisolationsbuffer B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris– HCl, 2,0 m saccharose. pH 7,4) og centrifugeres ved 16.000 g, 4 C C, 30 min. Pellets blev resuspenderet i 200ll PBS og opbevaret ved -20 C. C.,
Whole-cell og nukleare DNA-isolation
DNA fra enten 25 mg hel mus leveren eller 200 µL eller isolerede kerner blev udvundet ved hjælp af QIAmp® DNA Mini Kit (QIAgen), efter instruktioner fra producenten. Prøver blev elueret i DNA-resuspension buffer.,
Mitokondrie-DNA og nukleare DNA enrichments af qPCR
Tredive størrelsesordenen af mitokondrie-DNA, nukleare DNA-eller den samme mængde af det samlede DNA, der er ekstraheret fra hele musen leveren ved hjælp af de ovennævnte protokoller, blev forstærket i en Rotor-Gene Q real-time qPCR cycler (QIAgen) i henhold til standard protokoller med SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) i en 10 µL volumen reaktion., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
Mitokondrie-DNA fordøjelse af restriktionsenzymer
Renset mus mtDNA blev fordøjet af Hae-II eller Pst-jeg restriktionsendonukleaser (NEB, Whitby, ON, Canada) i henhold til producentens protokol. Fordøjede produkter (1, 5 µg) blev derefter opløst på en 0, 5% (w/v) agarosegel. Billeder blev erhvervet på et chemidoc MP gel dokumentationssystem (Bio-Rad). Fuld længde gel er præsenteret i supplerende Fig. 6d.,
S1 nuclease behandling af mitokondrie-DNA og nukleare DNA
30 µg af mtDNA, og nDNA blev fortyndet i 200 µL 1X S1-buffer og behandlet med 50 U S1 nuclease (Thermo Fischer Scientific) i 5 minutter ved 37 °C. Reaktion blev standset ved tilsætning af 600 mM EDTA (endelig koncentration) og inkubation ved 70 °C i 10 minutter. Prøverne blev udfældet ved tilsætning af 300 mM natriumacetat (slutkoncentration) og 2 volumener (v:v) absolut ethanol i 16 timer ved -20 C. C., Prøverne blev pelleteret ved 14.000 g, strålebehandling, 20 minutter og vasket 1 mL 70% ethanol og resuspenderet i DNA-resuspensionsbuffer. For konkurrenceanalyser fulgte ubehandlet nDNA og mtDNA den samme behandling uden tilsætning af en .ymet. Prøver blev doseret af .pcr.
Mitokondrier oxidation in-vitro
Doseres mitokondrier var i pilleform og resuspenderet ved en koncentration på 1,5 mg af mitokondrie-proteiner/mL i PBS, der indeholder 500 µM af oxidant tertbutyl hydroperoxide (TBHP) (Sigma-Aldrich)., Mitokondrier blev o .ideret i 1 time 30 min ved 37.C under forsigtig omrøring derefter skylles to gange med iskold PBS. O .iderede mitokondrier blev efterfølgende kvantificeret af BCA.
Mitokondrie-lipid oxidation
Thiobarbituric syre reaktive stoffer (TBARS) dannelse blev vurderet, hjælp TBARS Parameter Kit (R&D systemer, Minneapolis, MN, USA), efter fabrikantens anvisninger. To hundrede mikrogram mitokondrier blev lyseret, proteinerne blev udfældet under anvendelse af trichloreddikesyre (TCA) og pelleteret ved 12.000 g, stuetemperatur, 4 min., Supernatanterne blev overført til friske rør. Prøver (75 µL) blev inkuberet med 37,5 µL thiobarbituric syre i en 96-brønds plade i 3 timer ved 50 °C. Absorbances blev læst på 532 nm på en SpectraMax 190 mikropladelæser (Molekylære Enheder, Sunnyvale, CA, USA) og TBARS kvantificering blev udført ved hjælp af en standardkurve leveret i kittet. Oxideret prøver blev sammenlignet med kontrol mitokondrier, der blev inkuberet under de samme betingelser i PBS blottet for TBHP.,
Mitochondrial protein oxidation
dannelsen af carbonyl den ene eller begge sider følgende in-vitro mitokondrie-oxidation blev målt ved hjælp af det Protein Carbonyl Indhold Assay Kit (Sigma-Aldrich) efter fabrikantens anvisninger. Oxideret prøver blev sammenlignet med kontrol mitokondrier, der blev inkuberet under de samme betingelser i PBS blottet for TBHP.,
Påvisning af antistoffer rettet mod mitokondrie-epitoper ved ELISA
Til påvisning af anti-hele mitokondrie-antistoffer (AwMA), murine mitokondrier blev udvandet (500 µg/mL) i 50 mM-carbonat/bicarbonatbuffer, pH-værdi på 9,6 og 25 µL per var godt læsset på 96-godt halvdelen-område klare flad bund af polystyren høj-bindende microplates (Corning, New York, USA). Pladerne blev overtrukket i 18 timer ved 4 C C og derefter blokeret i 4 timer ved 37.C med PBS indeholdende 10% FBS og 0,5% gelatine. Efter tre vasker med PBS fortyndes sera 1:150 (medmindre andet er angivet) i PBS-10% FBS-0.,3% gelatine blev inkuberet natten over ved 4 C C i to eksemplarer. Efter tre vasker med PBS, blev pladerne inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med alkalisk fosfatase-(AP) konjugeret ged anti-mus eller anti-human IgG (Sigma-Aldrich) fortyndet 1:1.000 i PBS-0.4% bovint serumalbumin (BSA). Plader blev vasket tre gange med PBS og udviklet med p-nitrophenolphosphat (p-NPP) i ~30 minutter ved 37.C, og optiske tætheder (OD) blev læst ved 405 nm på en mikropladelæser., Den samme protokol blev anvendt til påvisning af autoantistoffer rettet mod submitochondriale partikler ved anvendelse af 25ll pr. brønd af SMP fortyndet (50 µg / mL) i 50 mM carbonat/bicarbonatbuffer, pH 9.6. En lignende fremgangsmåde blev anvendt for menneskelige mitokondrier med følgende modifikation: plader blev inkuberet med en peberrod peroxidase-konjugeret anti-human IgG sekundært antistof (1:3,000), peroxidase aktivitet, der blev afsløret ved stuetemperatur i ~5 min med 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB). Reaktionen blev stoppet med 2 N H2SO4 og ODs aflæst ved 450 nm., Til anti – mtDNA ELISA blev pladerne forbelagt med 1% protaminsulfat i dobbeltdestilleret vand i 1 time ved stuetemperatur. Pladerne blev vasket tre gange med PBS og overtrukket natten over ved 4.C med 400 ng mtDNA i PBS. Alle efterfølgende trin var identiske med dem, der blev brugt til A .ma-ELISAs. Blindværdier (mitokondrielle antigener og ingen sera) blev substraheret fra målte værdier for hver patient. Under udviklingen af disse analyser blev den korrekte belægning af brøndene testet ved anvendelse af isotype-matchede musemonoklonale antistoffer (MAB). Et monoklonalt antistof (klon IV.,3, 4 µg/mL) blev anvendt som en negativ assaykontrol i hvert tilfælde, mens forskellige monoklonale antistoffer blev anvendt, afhængigt af belægningsantigenerne, som positive assaykontroller: en anti-TOMM22 MAB (klon IC9-2, 4 µg / mL. Abcam) for intakte mitokondrier, en anti-DNA mAb (klon 35I9 DNA, 10 µg/mL. Abcam) eller et anti-cytochrom C mAb (klon 7H8. 2C12, 5 µg / mL. Bd Biosciences).,
Konkurrence-analysen
AwMA-ELISAs blev udført som beskrevet i de foregående afsnit, med følgende modifikationer: serumprøver, der var pre-inkuberes i fortynding buffer (1:150) tilsat forskellige koncentrationer (0.25, 1 og 3 mg/mL) konkurrenter (dvs mitokondrier eller røde blodlegemer mikropartikler) for 3 timer. ved RT og inkuberet i to eksemplarer natten over ved 4 C. C. Data præsenteres som den procentdel af signalet, der er tilbage efter hver konkurrence, sammenlignet med OD (405 nm) målt i fravær af konkurrenter.,
En tilsvarende procedure, der blev brugt til AmtDNA-ELISA, ved hjælp af øgede koncentrationer (0, 3, 9 og 27 ng/µL) af konkurrerende DNA (udvundet fra kerner, eller mitokondrier, med eller uden S1 nuclease behandling).
Statistik
Sammenligninger mellem grupper blev foretaget ved hjælp af enten Student ‘ s t-test, Wilcoxon test, Friedman eller Kruskal-Wallis test, en-vejs ANOVA, to-vejs eller gentagne målinger ANOVA, afhængigt af resultatet, samt antal og type af grupper., Når flere sammenligninger blev vurderet relevante post-hoc-korrektion tests blev brugt som Dunn ‘s, dunnetts, Sidak eller Bonferroni’ s. Associationer mellem AwMA, AmtDNA og anti-HSP60 blev beregnet med Spearman sammenhænge. Fordeling af disse antistoffer i henhold til ACA-resultater blev sammenlignet ved anvendelse af .ilco .on-test. Forbindelser mellem A .ma eller AmtDNA og kliniske resultater blev undersøgt ved bivariate og multivariate lineære og logistiske regressioner., Kliniske resultater undersøgt, er de gennemsnitlige, intima media tykkelse, ændring i procent af flow-medieret dilatation (FMD) af arterie brachialis, tilstedeværelse af mund-og klovesyge, tilstedeværelsen af plak i carotis, trombotiske event nogensinde, hvide blodlegemer, der tæller, blodplader, øget DNA-bindende ved Farr analysen over det normale interval for test laboratorium, tilstedeværelsen af andre skader i henhold til SLICC Skader Index (SDI > 0), høj aktivitet i henhold til SLEDAI-2K aktivitet score (SLEDAI ≥ 4), tilstedeværelse af lupus nefritis, biopsi klasse, samt chronicity og aktivitet indeks fra biopsi., Sidstnævnte blev justeret for sygdomsvarighed, alder, kropsmasseindeks (BMI), lavdensitetslipoproteiner (LDL) kolesterol, antimalarial medicin og prednison. Logistiske regressioner præsenteres med ulige nøgletal og deres 95% confidenceald konfidensinterval. Deltagernes resultater blev betragtet som positive for a .ma og AmtDNA, da deres værdi var over den afskårne værdi, der blev identificeret efter at have maksimeret Youdens indeks. Et 95% konfidensinterval blev opnået for afskæringen ved anvendelse af 10.000 bootstrap-prøver. Præstationsmålinger præsenteres med deres 95% nøjagtige konfidensinterval.,
Soft .are
Westernestern blot billeder blev erhvervet ved hjælp af billedstudie cifre 5.2 (LI-COR bioteknologi). mtDNA migration gennem agarosegel blev afbildet ved hjælp af Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). DLS-undersøgelser blev udført ved hjælp af den indbyggede softwareetasi .er 7.10-soft .are (Malvern Instruments). EM billeder blev erhvervet med det Image Capture Software 601.384 (Avanceret Mikroskopi Teknikker Corp., Woburn, MA, USA). Flo .cytometri blev udført ved hjælp af BD FACSDiva 6 6.1.3 (Bd Biosciences). Udbytter fra DNA-isolationer blev kvantificeret ved anvendelse af ND-1000 3.8.,1 software (Thermo Fisher Scientific) og qPCR blev udført med RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Optiske tætheder blev målt ved anvendelse af Softma.Pro 5.4.1 (molekylære enheder). Tallene blev samlet med ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) og Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain Vie., CA, USA). Statistiske analyser blev udført med Prism 7 soft .are (GraphPad Soft .are Inc . La Jolla, CA, USA) og SAS version 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).