PMC (Dansk)
Diskussion
Det er vigtigt at forholde sig gen-variationer, at de kliniske fænotyper ved hjælp af korrekt fænotyper værktøjer af CYP3A4 aktivitet. Det 3-hydroxylering af kinin havde vist sig som en biomarkør reaktion for CYP3A4 aktivitet, fordi 3-hydroxylering af kinin er katalyseret af CYP3A4 både in vivo og in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Derfor blev de kinetiske parametre for en .ymatisk katalyse på kinin 3-hydro .ylering anvendt som et mål for CYP3A4-aktivitet i den foreliggende undersøgelse.treogtyve af de rekombinante CYP3A4 holoen .ymer viste signifikant nedsat CLint over for kinin. Seks varianter, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift), og CYP3A4*21 (Y319C), udstillet meget lavere CLint for kinin (1.44–5.80%, Tabel 2) end wild-type CYP3A4*1A., Hvis vores in vitro resultater er gentaget i kliniske undersøgelser, at patienter, der er bærere af disse alleler kan være potentielt CYP3A4 fattige-metaboliseringsgrad og maj: i) at kræve lavere doser kinin til at nå terapeutiske plasmakoncentrationer; og ii) være en øget risiko for bivirkninger og toksicitet ved konventionelle doser af kinin, bruges.
CYP3A4*2 (S222P) udstillet en reduceret CLint af mere end seks gange (14.76%, Tabel 2) for kinin sammenlignet med vildtype-CYP3A4*1A., Denne nedsatte en .ymaktivitet kan skyldes, at en serin amino prolinaminosyresubstitution kan forårsage en større ændring i en dimensionalymets tredimensionelle struktur (prolin er kendt for at bryde alfa-helices). Ligeledes er CYP3A4 * 2 rapporteret at have en lavere CLint for mida .olam (Miya .aki et al ., 2008), nifedipin (Sata et al., 2000; Miya 2000aki et al., 2008), ibrutinib (uu et al., 2018) og lidocaine (Fang et al ., 2017), end for en .ymet vildtype. I modsætning hertil viste CYP3A4 * 2 en højere CLint for amiodaron (Yang et al., 2019)., For testosteron havde CYP3A4 * 2 en nedsat intrinsic clearance, når den blev udtrykt ved anvendelse af Escherichia coli e .press system in vitro (Miya .aki et al., 2008), men aktiviteten var sammenlignelig med en .ymet vildtype, når det udtrykkes i baculovirus-ekspressionssystem (Sata et al., 2000) (tabel 3).CYP3A4 * 3 (M445T) udviste lavere en .ymaktivitet over for kinin sammenlignet med allelen af vildtype (tabel 2)., Aminosyreresten 445 er placeret inden for det konserverede hæmbindende område, kun to aminosyre-C-terminaler til de absolut konserverede Cys i position 442 i CYP3A4-proteinet (Sata et al., 2000); derfor kan en Met445Thr-ændring udøve en ugunstig virkning på hæmbinding, hvilket resulterer i en ændring i en catalyticymets katalytiske aktivitet, især når man binder et egnet substrat. Men som anført i tabel 3 var den en .ymatiske aktivitet af CYP3A4*3 den samme som for CYP3A4 af vildtype for de fleste testede substrater., Uoverensstemmelsen mellem resultater kan opstå fra forskellige anvendte heterologe ekspressionsmetoder og på grund af forskellig substratspecificitet for varianten.
CYP3A4*4 (I118V) udstillet lavere CLint mod kinin, i forhold til wild-type CYP3A4*1A. Undersøgelser af site-directed mutagenese tyder på, at ser119 er en vigtig aminosyre, der er involveret som en aktiv-ejendommen rest (Yano et al., 2004). Derfor vil Ile118Val-mutationen sandsynligvis påvirke konformationen af det aktive sted, hvilket resulterer i nedsat katalytisk aktivitet., Tilsvarende, en in vivo undersøgelse viste, at forholdet mellem urin-niveau af 6βhydroxycortisol/gratis cortisol i disse heterozygote individer var lavere end i raske kontrolpersoner, hvilket tyder på, faldt enzymaktiviteter (Hsieh et al., 2001).
både CYP3A4*8 og *13 varianter viste påviselige, omend lavere, niveauer af CYP3A4 holoproteiner og havde ekstremt lave katalytiske aktiviteter over for kinin. I modsætning til vores resultater er CYP3A4*8 og *13 rapporteret at udvise ingen påviselige CYP holoproteiner, når de udtrykkes i bakteriesystemer(Eiselt et al ., 2001)., Vi spekulerer i, at brugen af bakterielle vs insekt ekspressionssystemer kan forklare de forskellige resultater. Bakterieudtrykssystemet mangler et intracellulært membranmiljø (Gon .ale.og Korekek .a, 1995), der kræves til høj ekspression af protein. I modsætning hertil kan insektceller behandle og modificere proteiner på en måde, der ligner humane celler, hvilket tillader korrekt foldning af en .ymet og inkorporering af hæm-cofaktoren, hvilket resulterer i højere ekspression af CYP3A4-proteiner.,CYP3A4 * 11 (T363M) blev udtrykt på signifikant lavere niveauer end CYP3A4 af vildtype (figur 2), hvilket er i overensstemmelse med undersøgelser, der anvender bakterie-eller pattedyrsekspressionssystemer (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). Threonin ved rest 363 inden for substratgenkendelsesstedet (SRS)-5 kan bidrage til dannelsen af hydrogenbindingsnetværket. En substitution fra threonin til methionin kan resultere i tab af katalytisk aktivitet (Murayama et al., 2002). CYP3A4 * 11 udviste derfor nedsat kininhydro .yleringsaktivitet i den aktuelle undersøgelse., Derudover viste CYP3A4 * 11 reduceret testosteronhydro .yleringsaktivitet (Murayama et al., 2002), havde bemærkelsesværdigt øget CLint mod lidocaine (Fang et al., 2017) og amiodaron (Yang et al., 2019), men var ikke forbundet med mærkbare ændringer i metaboliske aktiviteter for ibrutinib (.u et al., 2018) (tabel 3).CYP3A4 * 12 (L373F) viste en dramatisk nedsat CLint mod kinin, ligesom et tidligere forskningsresultat mod mida .olam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4*12 besidder en amino-syre ændring af Leu373Phe; de muterede rester ligger i nærheden af Arg-372 og Glu-374, som deltager i dannelsen af en brint-bonding) netværk og er aktivt involveret i anlæg i henhold til undersøgelser, der involverer site-directed mutagenese (Yano et al., 2004). Derfor mutational rest (L373F) er tilbøjelige til at påvirke stabiliteten af brint-bonding) netværk og rumlige udformning af aktive-site hulrummet, hvilket resulterer i ændret katalytisk aktivitet af CYP3A4*12.,CYP3A4 * 20 (488 frameshift) viste bemærkelsesværdigt formindsket apoproteinekspression (Figur 1) og reducerede dramatisk CLint mod kinin. I modsætning, ingen katalytisk aktiviteter af midazolam 1′- og 4-hydroxylering er blevet rapporteret i gær eller HEK 293 microsomes udtrykke CYP3A4*20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Disse modstridende resultater kan tilskrives de forskellige heterologe ekspressionssystemer og substrater, der anvendes i eksperimenterne. Derudover er en CYP3A4*20 Hetero .ygot, identificeret hos Brasilianske individer, rapporteret at udvise reduceret systemisk clearance på ∼1.,9 gange for mida .olam in vivo (Johnestlind-Johnsson et al., 2006). Det blev tidligere antaget, at denne sjældne mutation kunne påvirke proteinfoldning, hæm-inkorporering (Johnestlind-Johnsson et al., 2006), og den rumlige konformation af aktivt stedhulrum, hvilket giver anledning til et fald eller tab af katalytisk aktivitet forbundet med det anvendte substrat.CYP3A4*21 (Y319C), som blev identificeret i den kinesiske population (CYP3A4HOU et al., 2011), viste svag katalytisk aktivitet mod kinin i vores undersøgelse. Interessant nok blev der ikke identificeret noget påviseligt apoen .ym-udtryk i vores resultater., Tyr319 er en stærkt konserveret Rest i cytokrom P450-familien i hele eukaryote-evolutionen fra nematode til menneske (.hou et al., 2011). Ifølge i silico funktionelle forudsigelser (functionalhou et al., 2011), ligger Tyr319 rest på et vigtigt domæne, og en substitution af Tyr med Cys ved position 319 af CYP3A4*21-proteinet kan inducere dramatiske ændringer i aktiv-site hulrumskonfiguration. CYP3A4 * 21 kan derfor frembringe et funktionsfejl i proteinet med nedsat katalytisk aktivitet over for kinin., Derudover spekulerede vi på, at disse antistoffer, vi brugte til at påvise CYP3A4 rekombinante apoproteiner, måske ikke er egnede til at påvise varianten CYP3A4*21. Det vil sige, at mutationen af Tyr319Cys i CYP3A4*21 kan forhindre disse antistoffer i at genkende de specifikke epitoper i CYP3A4.
i modsætning hertil viste to af de rekombinante CYP3A4 holoen .ymer, CYP3A4*15 (R162.) og CYP3A4*29 (f113i), signifikant øget CLint for kinin. På samme måde udviste både CYP3A4*15 og CYP3A4*29 øget CLint over for lidocain (Fang et al., 2017), men viste nedsat CLint for ibrutinib (2017u et al., 2018)., CYP3A4 * 15 blev først påvist i forskellige etniske populationer med små prøver for hver etnisk gruppe (Lamba et al., 2002). CYP3A4 * 29 blev identificeret og navngivet i vores nylige undersøgelse (Hu et al ., 2017). De to varianter er relateret til hurtig metabolisme af kinin in vitro. Hvis bekræftelse af øget kinin clearance er fundet i individer, der er homozygote eller heterozygote bærere af CYP3A4*29 eller CYP3A4*15, disse personer kan være CYP3A4 ultra-hurtig metaboliseringsgrad af kinin., Patienter med disse genotyper kan: i) have dårligere terapeutisk effekt, når sædvanlige kliniske doser kinin administreres, og ii) kræve højere doser for at nå terapeutiske plasmakoncentrationer.
Ingen aktive holoenzymes af CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop), og CYP3A4*30 (R130Stop) varianter blev fundet, og i overensstemmelse hermed, de udviste ingen metaboliske aktivitet på kinin (Tabel 2).,
CYP3A4*6 har en indsættelse af en adenin rest i exon 9 (830-831 insA); denne mutation, der forårsager en frameshift, og det fører til oversættelse af en trunkeret protein, der ikke kan optage hæm (Hsieh et al., 2001). Derfor blev den katalytiske aktivitet af CYP3A4*6 over for kinin ikke identificeret i vores undersøgelse. Som tidligere vist in vivo, en Kinesisk person blev fundet til at være heterozygote for CYP3A4*6 med en meget lavere ratio af urin niveau af 6βhydroxycortisol:gratis cortisol end wild-type personer, hvilket tyder på, faldt CYP3A4 aktivitet (Hsieh et al., 2001)., Tilsvarende kan en patient, der er heterozygote for CYP3A4*6, undergår organtransplantation, havde en tacrolimus koncentration-at-justeret dosis forholdet 4.3-fold højere end i wild-type patienter (Jun et al., 2009).CYP3A4 * 26 har en C T T-nukleotidsubstitution i e .on 5. Dette medfører en ændring fra arginin til et for tidligt stopkodon i position 268 og resulterer i et formodet forkortet protein, der mangler katalytisk domæne og derfor aktivitet (.erk et al., 2014)., CYP3A4 * 26 må ikke udtrykkes på grund af det for tidlige stopkodon i position 268, eller hvis det er tilfældet, kan proteinet være mærket til hurtig nedbrydning (proteinerk et al., 2014). Derfor kunne vi ikke påvise holoproteinet af CYP3A4 * 26-varianten udtrykt i Sf21-celler. Ligeledes, en 19-årig nyre-transplanterede patient, der er identificeret som en homozygote for CYP3A4*26, og i mellemtiden er også en homozygote for CYP3A5*3, udviste en uventet høj plasma niveauet af tacrolimus, som følge af meget mindre tacrolimus clearance (Werk et al., 2014).,
i lighed med CYP3A4*26 har CYP3A4*30 en ændring fra arginin til et for tidligt stopkodon ved position 130 (Hu et al., 2017). Arg130 betragtes som vigtig for heme-inkorporering (Eiselt et al., 2001) og dermed mutation af Arg130 ville forstyrre hæm inkorporering og således påvirke holoen .ym ekspression af CYP3A4.
i kombination med tidligere undersøgelser (tabel 3) viste nogle CYP3A4-allelvarianter de forskellige præferencer for substraterne i modsætning til dem af en .ymer af vild type. Nemlig udviser nogle varianter ændrede katalytiske aktiviteter med en substratafhængig profil., Som diskuteret ovenfor kan modstridende resultater, der stammer fra et specifikt substrat i undersøgelser, opstå fra mange faktorer, såsom uoverensstemmelser fra in vitro eller in vivo-metode og forskellige heterologe ekspressionssystemer.
kinin har hyppige bivirkninger på grund af dets smalle terapeutiske indeks (Bateman og Dyson, 1986). Disse bivirkninger blev ikke kun induceret af medikamenter; de var også forårsaget af almindelige kininholdige drikkevarer., Baseret på en systematisk gennemgang af kliniske data fra hundrede fjorten artikler tegnede bivirkninger, der var resultatet af kininholdige drikkevarer, 20% af de samlede bivirkninger på kinin (Liles et al., 2016). Overraskende, selv med minuteksponering fra almindelige drikkevarer, oplevede nogle personer alvorlige bivirkninger, der involverede flere organsystemer. På grund af den åbenlyse interindividuelle mangfoldighed i kininfølsomhed kan variation i CYP3A4 være en mulig mekanisme, der ligger til grund for kininfølsomme og skadelige virkninger., Derudover er der ikke fastlagt regler for kininbrug i nogle lande, såsom piller, der indeholder 50 mg eller mindre kinin, betragtes som et naturligt sundhedsprodukt og fås uden recept i Canada (Liles et al., 2016); kininholdige lotioner og shampooer samt kininholdige drikkevarer forbliver almindeligt tilgængelige, og tilsyn er ikke påkrævet. Dermed, øget bevidsthed om interindividuelle forskelle i kininfølsomhed og bivirkninger på kinin blandt læger og offentligheden menes at være nødvendig.