Anti-mitochondriale Autoantikörper bei systemischem Lupus erythematodes und ihre Assoziation mit Krankheitsmanifestationen

Studienzulassung

Patientenpopulation

Die in dieser Studie getesteten menschlichen Seren wurden von einer vom REB (University Health Network Research Ethics Board) zugelassenen Studie an SLE – und APS-Patienten in Toronto sowie von gesunden Kontroll-und PBC-Patienten erhalten, die von CHU de Québec-Université Laval REB genehmigte Studien in Quebec City., SLE-Patienten mussten die 1982 ACR-Klassifikationskriterien für SLE erfüllen, die 199781,82 überarbeitet wurden, und APS-Patienten erfüllten die 1999 Sapporo-Kriterien für APS, die 200683,84 überarbeitet wurden. Für SLE wurden aufeinanderfolgende Patientinnen der University of Toronto Lupus Clinic (UTLC) angesprochen und zwischen August 2010 und Oktober 2011 die Zustimmung erteilt, Teil einer Studie zur Rolle von Fettsäuren und Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei Lupus zu sein. Sie stellten eine Blutprobe zur Verfügung und ließen ihre anonymisierten klinischen Daten mit ihrem Bioschema verknüpfen., In ähnlicher Weise wurden APS-Patienten, die in der rheumatologischen Klinik in Toronto gesehen wurden, nach einem ähnlichen Verfahren angesprochen. Alle verbleibenden Biospecimen könnten für zukünftige Studien an Biomarkern von Lupus gemäß der Zustimmung der ursprünglichen Probanden verwendet werden. Gesunde Kontrollpersonen wurden im Rahmen einer Studie zu Entzündungsmarkern rekrutiert, wenn sie keine bekannten Krankheiten hatten und zum Zeitpunkt der Blutentnahme keine infektiösen Symptome hatten. Alter und Geschlecht wurden zu dieser Zeit gesammelt. PBC-Patienten erfüllten die 2009 PBC-Klassifikationskriterien, überarbeitet in 201838,85 einschließlich der Positivität für anti-mitochondriale Antikörper.,

Daten aus klinischen Labors

Bei SLE-Patienten wurden Anti-dsDNA mit dem Farr-Assay (Labor – Cut-Off von 30%) und das Anti-Cardiolipin (IgG und IgM-Labor-Cut-Offs von 40 GPL-oder MPL-Einheiten) mit ELISA in einem klinischen Labor gemessen.

Zellkultur

Induzierbares Mausmodell von SLE

Die Empfehlungen des kanadischen Rates für Tierpflege wurden in einem vom Tierschutzausschuss der Université Laval genehmigten Protokoll befolgt., C57BL / 6 J wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) erhalten und in einer Elite-Plus-spezifisch-pathogenfreien Tieranlage an der CHU de Quebec untergebracht. SLE-Autoantikörper wurden in diesen Mäusen induziert, wie zuvor beschriebe63. Kurz gesagt, 6-8 Wochen alte männliche Mäuse erhielten 100 µL i. v. Injektionen von ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA), gefolgt 24 h später von einer 100 µL i. v. Injektion von Lipopolysaccharid (LPS von E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Diese Injektionen wurden nach 2 und 4 Wochen für insgesamt drei Impfrunden wiederholt und Mäuse wurden 48 h nach der dritten Immunisierung verblutet. C57BL / 6 J Mäuse injiziert i. v. mit PBS unter dem gleichen Zeitplan wurden als Kontrollen verwendet.

Während der gesamten Studie wurden Blutproben von Patienten unter informierter Zustimmung erhalten. Alle in dieser Studie vorgestellten Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften für Spender von Menschen und Mäusen durchgeführt.,

Mitochondrien-Isolierung

Mitochondrien wurden aus den Lebern von C57BL / 6 J-Mäusen nach einer Kombination von veröffentlichten Protokollen61,62 isoliert. Mäuse wurden durch zervikale Dislokation geopfert, die Leber wurde schnell entfernt, die Gallenblase ausgeschnitten und die Leber in eiskaltem PBS gespült (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Die Leber wurde dann zerkleinert und in eine vorgekühlte Glas-Teflon-Gewebemühle überführt, die 12 ml eiskalten mitochondrialen Isolationspuffer (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mm Saccharose) pro Gramm Leber enthielt, und dann gemahlen, bis eine homogene Suspension erhalten wurde. Intakte Zellen und Kerne wurden zweimal bei 700 g, 4 °C, 10 min pelletiert. Kontaminierende Membranen, Proteine und Organellen wurden durch zwei Zentrifugationen bei 7.000 g, 4 °C, 10 min eliminiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 g, 4 °C, 10 min., Die rohe mitochondrialen suspension wurde weiter gereinigt durch ultrazentrifugation gegen einen Percoll-Gradienten (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v:v Percoll) an die 95.000 g, 4 °C, 30 min. Die Band, die Mitochondrien enthielt, wurde in PBS gesammelt. Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um menschliche Mitochondrien zu isolieren, mit der Ausnahme, dass bis zu 107 Hep-G2-Zellen durch wiederholte Passagen durch eine Schmalspurnadel lysiert wurden., Das kommerzielle Kit QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Deutschland) wurde ebenfalls gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, um Mitochondrien aus Hep-G2-Zellen zum Qualitätsvergleich durch Western Blotting mit dem oben genannten Protokoll zu isolieren. Isolierte Mitochondrien wurden nach der Bicinchoninsäure-Methode (BCA) unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kits (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dosiert. Frisch isolierte Mitochondrien wurden in allen Experimenten verwendet, mit Ausnahme der submitochondrialen Teilchenpräparate, für die pelletierte Mitochondrien bei -80 °C gehalten wurden, bis sie benötigt wurden.,

Submitochondriale Partikel (SMP) Zubereitung

SMP wurden wie anderswo beschrieben hergestellt60. Kurzzeitig wurden gefrorene Mitochondrien bei Raumtemperatur aufgetaut und auf 10 mg mitochondriale Proteine in 10 mM 4-Morpholinepropansulfonsäure (MOPS) verdünnt. Die Proben wurden dann mit einem Fisher Sonic Dismembrator Model 500 (Thermo Scientific) bei 20% maximaler Leistung für 20 Sekunden soniert und dann 10 Minuten lang auf einem Salz-Eis-Wasserbad gehalten. Dieser Zyklus wurde neunmal wiederholt., Die Proben wurden dann bei 16.000 g, 4 °C, 10 Minuten zentrifugiert, um ungebrochene Mitochondrien und andere unerwünschte Ablagerungen zu verwerfen. Überstände wurden in einem frischen Röhrchen gesammelt und ihre Volumina in 10 mM MOPS auf 2 ml eingestellt. Die Proben wurden dann bei 150.000 g bei 4 °C für 45 Minuten ultrazentrifugiert. Gebeizte SMP wurden resuspendiert in SMP-Puffer (225 mM mannitol, 75 mM Saccharose, 10 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7,4) und dosiert werden. SMP-Präparate wurden bis zum Bedarf bei -80 °C gehalten.,

Rote Blutkörperchen Mikropartikel (RBCMP) Zubereitung

Rote Blutkörperchen (RBC) wurden aus dem Blut von gesunden menschlichen Freiwilligen durch Zentrifugation bei 282 g für 10 Minuten bei RT isoliert. RBC gezählt wurden (Cellometer Auto-M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) und angepasst, um eine Konzentration von 5 × 108 Zellen/mL in Tyrode ‚ s-Puffer (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4)., 109 Zellen wurden dann in 45 ml doppelt destilliertem Wasser verdünnt und 5 Minuten inkubiert. Die Tonizität des Puffers wurde dann durch Zugabe von 5 ml PBS 10X ausgeglichen (filtriert durch eine 0,22-µm-Membran). Reste von RBC wurden durch Zentrifugation bei 1.300 g für 5 Minuten bei RT entfernt und der Überstand wurde bei 18.000 g für 90 Minuten bei 18 °C zentrifugiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Assay gemessen.,

Western Blotting

Mitochondriale Größenmessung durch dynamische Lichtstreuung (DLS)

Die Größe der isolierten Mitochondrien wurde von DLS unter Verwendung eines Zetasizer Nano ZS-Geräts (Malvern instruments, Malvern, UK) gemessen, das mit dem Standardlaser 4 mW, 633 nm He-Ne als Lichtquelle ausgestattet ist und in einem Erfassungswinkel von 173°eingestellt ist. Die Experimente wurden dreimal in 1 cm langen Einweg-UV-Küvetten (Brand GMBH, Wertheim, Deutschland) repliziert, die 100 µL isolierte murine Mitochondrien enthielten, verdünnt in PBS in einer Konzentration von 10 µg Proteinen/µL., Folgende Parameter wurden bei der Messung der Größe des Mitochondriums berücksichtigt: Brechungsindex des Lösungsmittels: 1.330, Viskosität der Probe: 0.8872 mPas, Brechungsindex der Proteine: 1.45, Temperatur: 25 °C.

Elektronenmikroskopie

Mitochondrien (108) wurden 15 min bei Raumtemperatur in 3,5% Acrolein fixiert. Feste Proben wurden zweimal in PBS gespült und dann in 4% Agarose eingebettet. 50 µm Abschnitte wurden mit einem Vibratom geschnitten, 30 Minuten in 1% Osmiumtetroxid postfixiert und in Durcupanharz eingebettet., Siebzig-Nanometer-ultradünne Abschnitte wurden mit einem Tecnai G2 Spirit BioTWIN (FEI, Hillsboro, OR, USA) Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV visualisiert.

Beurteilung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs

Mitochondrien wurden in mitochondrialer Assaylösung resuspendiert (MAS: 70 mM Saccharose, 220 mM Mannitol, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA und 0,2% (w/v) fettsäurefreies BSA, pH 7,4 bei 37 °C) und ergänzt mit 10 mM Pyruvat, 2 mM Malat und 4 µM FCCP , pH 7,4. Ein Äquivalent von 10 µg Proteinen wurde auf XF-96-Platten ausgesät (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Die Platten wurden dann 2.000 g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Wir visualisierten die Verteilung der Mitochondrien unter einem Hellfeldmikroskop, um Adhärenz und homogene Aufteilung zu gewährleisten. Die Platten wurden vor dem Beladen etwa 40 Minuten lang bei 37 °C ohne CO2 gehalten. Die Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) wurden gemäß Herstellerangaben (Agilent/Seahorse Bioscience) gemessen. Experimente repliziert wurden in drei Brunnen und gemittelt für jede experimentelle Bedingung., Insgesamt wurden 3 Messungen des Sauerstoffverbrauchs für jede Bedingung ungefähr alle 6 Minuten unter basalen Bedingungen und nach sequentieller Zugabe von Rotenon (2 µM), Succinat (10 mM), Antimycin A (40 µM) und TMPD (N,N,N‘,N‘-Tetramethyl-p-Phenylendiamin)/Ascorbat (100 µM/10 mM) durchgeführt. Succinat wurde als Elektronenspender für Komplex II, Rotenon als Komplex-I-Inhibitor, Antimycin A als Komplex-III-Inhibitor und Atmung durch Komplex IV unter Verwendung von TMPD/Ascorbat gemessen.,

Hochempfindliche Durchflusszytometrie

Aufgrund ihrer geringen Größe wurden Mitochondrien durch hochempfindliche Durchflusszytometrie unter Verwendung einer „Small particle Option“ nachgewiesen, die aus einer Vorwärtsstreuung (FSC) besteht, die an eine Photomultiplier-Röhre (PMT) gekoppelt ist, die auf einem BD FACS Canto II Special Order Research Product (SORP, BD Biosciences) montiert ist. Mitochondrien (0,5 µg) wurden mit 1 µg Anti-TOMM22-Atto 488 (Clone IC9-2, Sigma-Aldrich) und 1 µM Mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 30 Minuten lang bei 37 °C gefärbt und mit PBS auf ein Endvolumen von 500 µl vor der Durchflusszytometrieanalyse verdünnt., Um die Anzahl der Mitochondrien quantitativ zu messen, verwendeten wir 3 µm Durchmesser Polystyrolmikrosphäre (Polysciences, PA, USA). 80.000 Mikrokugeln wurden zu jeder Probe hinzugefügt und 500 Mikrokugeln wurden erworben. Silica-Partikel (Kisker Biotech, Steinfurt, Deutschland) wurden verwendet, um zu bestimmen, 100-1,000 nm Größe skalieren.

Mitochondriale DNA-Extraktion durch alkalische Lyse

Isolierte Mitochondrien wurden bei 10.000 g, 4 °C, 10 min pelletiert und in 0,8 mL mtDNA-Isolationspuffer A für jeweils 3 mg mitochondriale Proteine resuspendiert., Mitochondrien wurden dann in einem Volumen (v:v) mtDNA-Isolationspuffer B (extemporan präpariert. 0,2 M NaOH, 1% SDS) für 3 min. auf Eis, unter sanfter Erregung. mtDNA-Suspensionen wurden mit einem Volumen (v:v) mtDNA-Isolationspuffer C (1,32 M Kaliumacetat, pH 4,8 eingestellt mit eiskalter Essigsäure) für 5 min neutralisiert. auf Eis, unter sanfter Erregung. Mitochondriale Trümmer wurden durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 14.000 g pelletiert, RT. Überstände wurden in frische Röhrchen überführt. mtDNA wurde über Nacht bei -20 °C mit 0 ausgefällt.,1 Volumen (v:v) Kaliumacetat (Stammlösung: 3 M Natriumacetat, pH-Wert mit eiskalter Essigsäure auf 5,2 eingestellt) und 0,7 Volumen (v:v) absolutes Isopropanol. mtDNA wurde dann bei 14.000 g granuliert, dreimal mit 1,5 ml 70% Ethanol gewaschen und in DNA-Resuspensionspuffer resuspendiert (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). Die mitochondriale DNA-Konzentration wurde durch Spektrophotometrie bestimmt (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).

Kerne Isolierung von Maus-Hepatozyten

die Kerne wurden isoliert von Maus-Lebern mit veröffentlicht methods86., Kurz gesagt wurden während Mitochondrien-Isolationsprotokollen, während Überstände zur Durchführung von Mitochondrien-Isolationen verwendet wurden, Pellets aus der ersten 700 g Zentrifugation in 10 ml eiskaltem Kern-Isolationspuffer A (5 mM MgCl2, 10 mM Tris–HCl, 250 mM Saccharose) resuspendiert. pH 7.4) und in einer vorgekühlten Glas/Teflon-Gewebemühle gemahlen. Die Suspension wurde weiter durch drei Durchgänge durch eine 25 G5/8-Messnadel unterbrochen, gefolgt von zwei Durchgängen durch eine 27 G ½ – Messnadel., Die Suspension wurde dann gegen ein 40 µM Nylonzellensieb (Thermo Fisher Scientific) filtriert und bei 600 g, 4 °C, 10 min zentrifugiert. Pellets wurden in 14 ml Puffer A resuspendiert und bei 600 g, 4 °C, 10 min zentrifugiert. Pellets wurden dann in 9 Volumina eiskalter Kernisolationspuffer B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 2,0 M Saccharose) resuspendiert. pH 7,4) und zentrifugiert bei 16.000 g, 4 °C, 30 min. Pellets wurden in 200 µL PBS resuspendiert und bei -20 °C gelagert.,

Ganzzell-und Kern-DNA-Isolierung

DNA aus entweder 25 mg ganzer Mausleber oder den 200 µL oder isolierten Kernen wurde mit QIAmp® DNA Mini Kit (QIAgen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Proben wurden in DNA-Resuspensionspuffer eluiert.,

mitochondriale DNA und nukleare DNA-Anreicherung durch qPCR

Dreißig Nanogramm mitochondriale DNA, nukleare DNA oder die gleiche Menge an Gesamt-DNA, die unter Verwendung der oben genannten Protokolle aus der gesamten Mausleber extrahiert wurde, wurden in einem qPCR-Echtzeit-qPCR-Cycler (QIAgen) des Rotors in einem qPCR-Cycler (QIAgen) gemäß Standardprotokollen mit SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) in einem Reaktionsvolumen von 10 µL amplifiziert., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,

Mitochondriale DNA-Verdauung durch Restriktionsenzyme

Gereinigte Maus-mtDNA wurde durch Hae II-oder Pst I-Restriktionsendonukleasen (NEB, Whitby, ON, Kanada) gemäß dem Herstellerprotokoll verdaut. Verdaute Produkte (1,5 µg) wurden dann auf einem 0,5% (w/v) Agarosegel aufgelöst. Die Bilder wurden auf einem Chemidoc MP Gel-Dokumentationssystem (Bio-Rad) aufgenommen. Gel in voller Länge ist in der Abb. 6d.,

S1 Nuclease Behandlung von mitochondrialer DNA und Kern-DNA

30 µg mtDNA und nDNA wurden in 200 µL 1X S1-Puffer verdünnt und 5 Minuten lang mit 50 U S1 Nuclease (Thermo Fischer Scientific) bei 37 °C behandelt. Die Proben wurden durch Zugabe von 300 mm Natriumacetat (Endkonzentration) und 2 Volumina (v:v) absolutem Ethanol für 16 Stunden bei -20 °C ausgefällt., Die Proben wurden bei 14.000 g, RT, 20 Minuten pelletiert und 1 ml 70% Ethanol gewaschen und in DNA-Resuspensionspuffer resuspendiert. Bei Wettbewerbstests folgten unbehandelte nDNA und mtDNA der gleichen Behandlung ohne Zugabe des Enzyms. Proben wurden von qPCR dosiert.

Mitochondrien-Oxidation in vitro

Dosierte Mitochondrien wurden in einer Konzentration von 1,5 mg mitochondrialen Proteinen/ml in PBS mit 500 µM des Oxidationsmittels Tertbutylhydroperoxid (TBHP) (Sigma-Aldrich) granuliert und resuspendiert., Mitochondrien wurden für 1 h 30 min bei 37 °C unter sanfter Bewegung oxidiert und dann zweimal mit eiskaltem PBS gespült. Oxidierte Mitochondrien wurden anschließend durch BCA quantifiziert.

Mitochondriale Lipidoxidation

Die Bildung von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) wurde unter Verwendung des TBARS-Parameter-Kits (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers beurteilt. Zweihundert Mikrogramm Mitochondrien wurden lysiert, die Proteine mit Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt und bei 12.000 g Raumtemperatur 4 min pelletiert., Die Überreste wurden in frische Röhrchen überführt. Proben (75 µL) wurden mit 37,5 µL Thiobarbitursäure in einer 96-Well-Platte für 3 h bei 50 °C inkubiert.Absorptionen wurden bei 532 nm auf einem SpectraMax 190-Mikroplattenleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) abgelesen und die TBARS-Quantifizierung wurde unter Verwendung einer im Kit bereitgestellten Standardkurve durchgeführt. Oxidierte Proben wurden mit Kontrollmitochondrien verglichen, die unter den gleichen Bedingungen in PBS ohne TBHP inkubiert wurden.,

Mitochondriale Proteinoxidation

Die Bildung von Carbonylmoieties nach In-vitro – mitochondrialer Oxidation wurde mit dem Protein Carbonyl Content Assay Kit (Sigma Aldrich) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Oxidierte Proben wurden mit Kontrollmitochondrien verglichen, die unter den gleichen Bedingungen in PBS ohne TBHP inkubiert wurden.,

Nachweis von Antikörpern gegen mitochondriale Epitope durch ELISA

Zum Nachweis von Anti-Whole mitochondrialen Antikörpern (AwMA) wurden murine Mitochondrien verdünnt (500 µg/ml) in 50 mm Carbonat / Bicarbonat-Puffer, pH 9,6 und 25 µL pro Well wurden auf 96-Well-Halbflächen-klare Polystyrol-hochbindende Mikroplatten mit flachem Boden geladen (Corning, New York, USA). Die Platten wurden für 18 h bei 4 °C beschichtet und dann für 4 h bei 37 °C mit PBS blockiert, das 10% FBS und 0,5% Gelatine enthielt. Nach drei Wäschen mit PBS verdünnte Seren 1:150 (sofern nicht anders angegeben) in PBS-10% FBS-0.,3% Gelatine wurden über Nacht bei 4 °C doppelt inkubiert. Nach drei Wäschen mit PBS wurden die Platten 1 h bei Raumtemperatur mit alkalischer Phosphatase-(AP) konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-oder Anti-Human-IgG (Sigma-Aldrich) 1:1.000 in PBS-0,4% Rinderserumalbumin (BSA) inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit p-Nitrophenolphosphat (p-NPP) für ~30 min bei 37 °C entwickelt und optische Dichten (OD) wurden bei 405 nm auf einem Mikroplattenleser abgelesen., Das gleiche Protokoll wurde für den Nachweis von Autoantikörpern verwendet, die auf submitochondriale Partikel abzielen, indem 25 µL pro Vertiefung SMP verdünnt (50 µg/ml) in 50 mm Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9.6, verwendet wurden. Ein ähnlicher Ansatz wurde für humane Mitochondrien mit der folgenden Modifikation verwendet: Platten wurden mit einem Meerrettich-Peroxidase-konjugierten anti-humanen IgG-sekundären Antikörper (1:3,000) inkubiert, Peroxidase-Aktivität wurde bei Raumtemperatur für ~5 min mit 3,3′,5,5′ – Tetramethylbenzidin (TMB). Die Reaktion wurde mit 2 N H2SO4 gestoppt und der ODs bei 450 nm abgelesen., Für den Anti-mtDNA-ELISA wurden Platten mit 1% Protaminsulfat in doppelt destilliertem Wasser für 1 h bei Raumtemperatur vorbeschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und über Nacht bei 4 °C mit 400 ng mtDNA in PBS beschichtet. Alle nachfolgenden Schritte waren identisch mit denen für AwMA-ELISAs. Leere Werte (mitochondriale Antigene und keine Seren) wurden von den Messwerten für jeden Patienten subtrahiert. Während der Entwicklung dieser Assays wurde die richtige Beschichtung der Vertiefungen unter Verwendung von monoklonalen MAB-Antikörpern (Isotyp-Matched Mouse Monoclonal Antibodies) getestet. Ein monoklonaler Antikörper (Klon IV.,3, 4 µg/ml) wurde als negative Assaykontrolle in jedem Fall verwendet, während verschiedene monoklonale Antikörper, abhängig von den Beschichtungsantigenen, als positive Assaykontrolle verwendet wurden: ein Anti-TOMM22 mAb (Klon IC9-2, 4 µg / ml. Abcam) für intakte Mitochondrien eine Anti-DNA-mAb (Klon 35I9 DNA, 10 µg/ml. Abcam) oder eine anti-Cytochrom-C-mAb (Klon 7H8.2C12, 5 µg/mL. BD Biosciences).,

Competition Assay

AwMA-ELISAs wurden wie in den vorherigen Abschnitten beschrieben mit folgenden Modifikationen durchgeführt: Serumproben wurden in Verdünnungspuffer (1:150) vor inkubiert und mit verschiedenen Konzentrationen (0,25, 1 und 3 mg/ml) von Konkurrenten (d. H. Mitochondrien oder Mikropartikeln roter Blutkörperchen) für 3 Stunden versetzt. bei RT und inkubiert in zweifacher Über Nacht bei 4 °C. Die Daten werden als Prozentsatz des Signals dargestellt, das nach jedem Wettbewerb verbleibt, verglichen mit dem OD (405 nm), der in Abwesenheit von Wettbewerbern gemessen wurde.,

Ein ähnliches Verfahren wurde für AmtDNA-ELISA verwendet, wobei erhöhte Konzentrationen (0, 3, 9 und 27 ng/µL) konkurrierender DNA (extrahiert aus Kernen oder Mitochondrien mit oder ohne S1-Nukleasebehandlung) verwendet wurden.

Statistik

Vergleiche zwischen Gruppen wurden entweder mit T-Test des Schülers, Wilcoxon-Test, Friedman oder Kruskal-Wallis-Tests, Einweg-ANOVA, Zweiwege-oder wiederholte Messungen ANOVA je nach Ergebnis, sowie die Anzahl und Art der Gruppen., Wenn Sie mehrere Vergleiche wurden bewertet, entsprechende post-hoc-Korrektur-tests verwendet wurden, wie die Dunn ‚ s, Dunnett s, Sidak oder Bonferroni ist. Assoziationen zwischen AwMA, AmtDNA und anti-HSP60 berechnet wurden mit Spearman-Korrelationen. Verteilung dieser Antikörper nach ACA Ergebnisse wurden mit Wilcoxon-Test verglichen. Assoziationen zwischen AwMA oder AmtDNA und klinischen Ergebnissen wurden durch bivariate und multivariate lineare und logistische Regressionen untersucht., Die untersuchten klinischen Ergebnisse sind die durchschnittliche Dicke der Intima-Medien, die prozentuale Veränderung der durchflussvermittelten Dilatation (MKS) der Arteria brachialis, das Vorhandensein von MKS, das Vorhandensein von Plaque in der Carotis, thrombotische Ereignisfaktoren, die Anzahl der weißen Blutkörperchen, die Thrombozytenzahl, erhöhte DNA-Bindung durch Farr-Assay über dem normalen Bereich für Testlabor, Vorhandensein von Schäden gemäß SLICC-Schadensindex (SDI > 0), hohe Aktivität gemäß SLEDAI-2K Activity Score (SLEDAI ≥ 4), vorhandensein von Lupus Nephritis, Biopsie-Klasse, sowie Chronizität und Aktivitätsindex aus der Biopsie., Letztere wurden an Krankheitsdauer, Alter, Body-Mass-Index (BMI), Low-Density-Lipoproteine (LDL) Cholesterin, Malariamedikamente und Prednison angepasst. Logistische Regressionen werden mit ungeraden Verhältnissen und ihrem 95% Wald-Konfidenzintervall dargestellt. Die Ergebnisse der Teilnehmer wurden für AwMA und AmtDNA als positiv angesehen, wenn ihr Wert über dem Cut-Off-Wert lag, der nach Maximierung des Youden-Index ermittelt wurde. Ein 95% iges Konfidenzintervall wurde für den Cut-Off unter Verwendung von 10.000 Bootstrap-Proben erhalten. Performance-Maßnahmen vorgestellt werden mit Ihren 95% exaktes Konfidenzintervall.,

Software

Western-blot-Bilder wurden erworben, die mit Bild-Studio Ziffern 5.2 (LI-COR Biotechnologie). Die mtDNA-Migration durch Agarosegel wurde mit Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad) abgebildet. DLS-Studien wurden mit der integrierten Zetasizer 7.10-Software (Malvern Instruments) durchgeführt. EM-Bilder wurden mit der Bilderfassungssoftware 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA) aufgenommen. Die Durchflusszytometrie wurde mit BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biosciences) durchgeführt. Die Erträge aus DNA-Isolationen wurden mit der ND-1000-Methode quantifiziert.,1 software (Thermo Fisher Scientific) und rTQ-PCR wurden durchgeführt, mit RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Optische Dichten wurden mit SoftMax Pro 5.4.1 (Molecular Devices) gemessen. Figuren montiert wurden mit ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) und Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA). Statistische Analysen wurden mit Prism 7-software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) und SAS version 9.4 (SAS Institute Inc. Cary , NC, USA).

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