PMC (Deutsch)
Diskussion
Es ist wichtig, Genvariationen mit klinischen Phänotypen unter Verwendung geeigneter Phänotypisierungswerkzeuge der CYP3A4-Aktivität in Beziehung zu setzen. Die 3-Hydroxylierung von Chinin wurde als Biomarkerreaktion für die CYP3A4-Aktivität nachgewiesen, da die 3-Hydroxylierung von Chinin sowohl in vivo als auch in vitro durch CYP3A4 katalysiert wird (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Daher wurden die kinetischen Parameter der enzymatischen Katalyse auf Chinin-3-Hydroxylierung als Maß für CYP3A4-Aktivität in der vorliegenden Studie verwendet.
Dreiundzwanzig der rekombinanten CYP3A4-Holoenzyme zeigten einen signifikant verringerten CLint gegenüber Chinin. Sechs Varianten, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift) und CYP3A4*21 (Y319C), ausgestellt viel niedriger CLint für Chinin (1.44–5.80%, Tabelle 2), als wild-Typ CYP3A4*1A., Wenn unsere In-vitro-Befunde in klinischen Studien repliziert werden, können Patienten, die Träger dieser Allele sind, potenziell CYP3A4-schlechte Metabolisierer sein und können: i) niedrigere Chinindosen benötigen, um therapeutische Plasmakonzentrationen zu erreichen; und ii) ein erhöhtes Risiko für Nebenwirkungen und Toxizität haben, wenn herkömmliche Chinindosen verwendet werden.
CYP3A4*2 (S222P) zeigte einen reduzierten CLint von mehr als sechsfach (14,76%, Tabelle 2) für Chinin im Vergleich zu Wildtyp CYP3A4*1A., Diese verminderte enzymatische Aktivität könnte darauf zurückzuführen sein, dass eine Serin→Prolin-Aminosäuresubstitution eine wesentliche Veränderung der dreidimensionalen Struktur des Enzyms verursachen könnte (es ist bekannt, dass Prolin Alpha-Helices bricht). Ebenso wurde berichtet, dass CYP3A4*2 einen niedrigeren CLint für Midazolam besitzt (Miyazaki et al., 2008), Nifedipin (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018) und Lidocain (Fang et al., 2017), als das des Wildtypenzyms. Im Gegensatz dazu zeigte CYP3A4*2 einen höheren CLint für Amiodaron (Yang et al., 2019)., Für Testosteron hatte CYP3A4*2 eine verminderte intrinsische Clearance, wenn es mit Escherichia coli express system in vitro exprimiert wurde (Miyazaki et al., 2008), aber die Aktivität war vergleichbar mit dem Wildtypenzym, wenn es im Baculovirus-Expressionssystem exprimiert wurde (Sata et al., 2000) (Tabelle 3).
CYP3A4*3 (M445T) zeigte im Vergleich zum Wildtyp-Allel eine geringere enzymatische Aktivität gegenüber Chinin (Tabelle 2)., Der Aminosäurerest 445 befindet sich innerhalb der konservierten Häm-bindenden Region, nur zwei Aminosäure-C-Terminals zu den absolut konservierten Cys an Position 442 im CYP3A4-Protein (Sata et al., 2000); Daher kann eine Met445Thr-Änderung eine ungünstige Wirkung auf die Hämbindung ausüben, was zu einer Veränderung der katalytischen Aktivität des Enzyms führt, insbesondere wenn ein geeignetes Substrat gebunden wird. Aber wie in Tabelle 3 erwähnt, war die enzymatische Aktivität von CYP3A4*3 ähnlich der des Wildtyps CYP3A4 für die meisten getesteten Substrate., Die Diskrepanz der Ergebnisse kann sich aus verschiedenen verwendeten heterologen Expressionsmethoden und aufgrund unterschiedlicher Substratspezifität für die Variante ergeben.
CYP3A4*4 (I118V) zeigte einen niedrigeren CLint gegenüber Chinin im Vergleich zu CYP3A4*1A vom Wildtyp. Studien zur standortgerichteten Mutagenese legen nahe, dass ser119 eine Schlüsselaminosäure ist, die als Rückstand an aktiver Stelle beteiligt ist (Yano et al., 2004). Daher beeinflusst die ILE-Val-Mutation wahrscheinlich die Konformation der aktiven Stelle, was zu einer verminderten katalytischen Aktivität führt., In ähnlicher Weise zeigte eine in-vivo-Studie, dass das Verhältnis des Harnspiegels von 6β-Hydroxycortisol / freiem Cortisol bei diesen heterozygoten Individuen niedriger war als bei gesunden Kontrollen, was auf eine verminderte enzymatische Aktivität hindeutet (Hsieh et al., 2001).
Beide CYP3A4*8-und *13-Varianten zeigten nachweisbare, wenn auch niedrigere CYP3A4-Holoproteine und hatten extrem niedrige katalytische Aktivitäten gegenüber Chinin. Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen wurde berichtet, dass CYP3A4*8 und * 13 keine nachweisbaren CYP-Holoproteine aufweisen, wenn sie in bakteriellen Systemen exprimiert werden (Eiselt et al., 2001)., Wir spekulieren, dass die Verwendung von bakteriellen vs. Insektenexpressionssystemen die unterschiedlichen Ergebnisse erklären kann. Dem bakteriellen Expressionssystem fehlt eine intrazelluläre Membranumgebung (Gonzalez und Korzekwa, 1995), die für eine hohe Proteinexpression erforderlich ist. Im Gegensatz dazu können Insektenzellen Proteine ähnlich wie menschliche Zellen verarbeiten und modifizieren, was eine ordnungsgemäße Faltung des Enzyms und den Einbau des Häm-Cofaktors ermöglicht, was zu einer höheren Expression von CYP3A4-Proteinen führt.,
CYP3A4*11 (T363M) wurde in signifikant niedrigeren Konzentrationen exprimiert als CYP3A4 vom Wildtyp (Abbildung 2), ein Befund, der mit Studien mit Bakterien-oder Säugetierexpressionssystemen übereinstimmt (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). Threonin am Rückstand 363 innerhalb der Substraterkennungsstelle (SRS)-5 kann zur Bildung von Wasserstoffbindungsnetzwerken beitragen. Eine Substitution von Threonin zu Methionin kann zum Verlust der katalytischen Aktivität führen (Murayama et al., 2002). So zeigte CYP3A4*11 reduzierte Chininhydroxylierungsaktivität in der aktuellen Studie., Darüber hinaus zeigte CYP3A4*11 eine reduzierte Testosteronhydroxylierungsaktivität (Murayama et al., 2002), hatte den CLint gegenüber Lidocain bemerkenswert erhöht (Fang et al., 2017) und Amiodaron (Yang et al., 2019), war aber nicht mit merklichen Veränderungen der Stoffwechselaktivitäten für Ibrutinib verbunden (Xu et al., 2018) (Tabelle 3).
CYP3A4*12 (L373F) zeigte einen dramatisch verminderten CLint gegenüber Chinin, ähnlich wie bei einem früheren Forschungsergebnis gegenüber Midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4*12 besitzt eine Aminosäureänderung von Leu373Phe; Der mutierte Rückstand befindet sich in der Nähe von Arg-372 und Glu-374, die an der Bildung eines Wasserstoffbindungsnetzwerks beteiligt sind und an aktiven Stellen beteiligt sind Studien mit standortgerichteter Mutagenese (Yano et al., 2004). Daher ist es wahrscheinlich, dass der Mutationsrückstand (L373F) die Stabilität des Wasserstoffbindungsnetzes und die räumliche Konformation des Hohlraums an der aktiven Stelle beeinflusst, was zu einer veränderten katalytischen Aktivität von CYP3A4*12 führt.,
CYP3A4*20 (488 Frameshift) zeigte eine bemerkenswert verminderte Apoproteinexpression (Abbildung 1) und eine dramatisch reduzierte CLint gegenüber Chinin. Im Gegensatz dazu wurden keine katalytischen Aktivitäten der Midazolam – 1′-und 4-Hydroxylierung in Hefe-oder HEK 293-Mikrosomen berichtet, die CYP3A4*20 exprimierten (Westlind-Johnsson et al., 2006). Diese widersprüchlichen Ergebnisse können auf die verschiedenen heterologen Expressionssysteme und Substrate zurückzuführen sein, die in den Experimenten verwendet werden. Darüber hinaus wurde berichtet, dass eine CYP3A4*20-Heterozygote, die bei brasilianischen Individuen identifiziert wurde, eine verringerte systemische Clearance von ∼1 aufweist.,9-Fach für midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Zuvor wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese seltene Mutation die Proteinfaltung, die Häm-Inkorporation beeinflussen könnte (Westlind-Johnsson et al., 2006), und die räumliche Konformation des Aktiv-Site-Hohlraums, was zu einer Abnahme oder einem Verlust der katalytischen Aktivität führt, die mit dem verwendeten Substrat verbunden ist.
CYP3A4*21 (Y319C), das in der chinesischen Bevölkerung identifiziert wurde (Zhou et al., 2011), zeigte in unserer Studie eine schwache katalytische Aktivität gegenüber Chinin. Interessanterweise wurde in unseren Ergebnissen keine nachweisbare Apoenzymexpression identifiziert., Tyr319 ist ein hochkonservierter Rückstand in der Cytochrom P450-Familie während der gesamten Eukaryotenentwicklung vom Nematoden zum Menschen (Zhou et al., 2011). Nach in silico funktionellen Vorhersagen (Zhou et al., 2011), Tyr319-Rückstand liegt auf einer wichtigen Domäne und eine Substitution von Tyr mit Cys an Position 319 des CYP3A4*21-Proteins kann dramatische Veränderungen in der Aktiv-Site-Hohlraumkonfiguration induzieren. Daher kann das CYP3A4*21 ein fehlerhaftes Protein mit reduzierter katalytischer Aktivität gegenüber Chinin produzieren., Darüber hinaus spekulierten wir, dass diese Antikörper, die wir zum Nachweis von rekombinanten CYP3A4-Apoproteinen verwendeten, möglicherweise nicht zum Nachweis der Variante CYP3A4*21 geeignet sind. Das heißt, die Mutation von Tyr319Cys in CYP3A4*21 kann verhindern, dass diese Antikörper die spezifischen Epitope in CYP3A4 erkennen.
Im Gegensatz dazu zeigten zwei der rekombinanten CYP3A4-Holoenzyme CYP3A4*15 (R162Q) und CYP3A4*29 (F113I) einen signifikant erhöhten CLint für Chinin. In ähnlicher Weise zeigten sowohl CYP3A4*15 als auch CYP3A4*29 eine erhöhte CLint gegenüber Lidocain (Fang et al., 2017), zeigte jedoch einen verringerten CLint für Ibrutinib (Xu et al., 2018)., CYP3A4 * 15 wurde zuerst in verschiedenen ethnischen Populationen mit kleinen Stichproben für jede ethnische Gruppe nachgewiesen (Lamba et al., 2002). CYP3A4 * 29 wurde in unserer jüngsten Studie identifiziert und benannt (Hu et al., 2017). Die beiden Varianten stehen im Zusammenhang mit dem schnellen Metabolismus von Chinin in vitro. Wenn eine Bestätigung einer erhöhten Chinin-Clearance bei Personen gefunden wird, die homozygote oder heterozygote Träger von CYP3A4*29 oder CYP3A4*15 sind, können diese Personen CYP3A4 ultraschnelle Metabolisierer von Chinin sein., Patienten mit diesen Genotypen können: i) eine schlechtere therapeutische Wirksamkeit haben, wenn übliche klinische Dosen von Chinin verabreicht werden; und ii) erfordern höhere Dosen, um therapeutische Plasmakonzentrationen zu erreichen.
Es wurden keine aktiven Holoenzyme der Varianten CYP3A4*6 (277 Frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop) und CYP3A4*30 (R130Stop) nachgewiesen und dementsprechend zeigten sie keine metabolische Aktivität auf Chinin (Tabelle 2).,
CYP3A4*6 hat eine Insertion eines Adeninrestes in Exon 9 (830-831 insA); Diese Mutation verursacht ein Frameshift und führt zur Translation eines abgeschnittenen Proteins, das kein Häm enthalten kann (Hsieh et al., 2001). Folglich wurde die katalytische Aktivität von CYP3A4*6 gegenüber Chinin in unserer Studie nicht identifiziert. Wie zuvor in vivo gezeigt, war eine chinesische Person heterozygot für CYP3A4*6 mit einem viel niedrigeren Verhältnis des Harnspiegels von 6β-Hydroxycortisol: freiem Cortisol als Wildtyp-Individuen, was auf eine verminderte CYP3A4-Aktivität hindeutet (Hsieh et al., 2001)., In ähnlicher Weise hatte ein Patient, der heterozygot für CYP3A4*6 ist und sich einer Organtransplantation unterzog, ein Tacrolimus-Konzentrations-zu-adjustiertes Dosisverhältnis, das 4,3-fach höher war als das von Wildtyp-Patienten (Jun et al., 2009).
CYP3A4 * 26 hat eine C→T-Nukleotidsubstitution in Exon 5. Dies bewirkt einen Wechsel von Arginin zu einem vorzeitigen Stop-Codon an Position 268 und führt zu einem vermeintlich verkürzten Protein ohne katalytische Domäne und damit Aktivität (Werk et al., 2014)., CYP3A4 * 26 kann aufgrund des vorzeitigen Stop-Codons an Position 268 nicht exprimiert werden, oder wenn dies der Fall ist, kann das Protein für einen schnellen Abbau markiert sein (Werk et al., 2014). Dementsprechend konnten wir das in Sf21-Zellen exprimierte Holoprotein der CYP3A4*26-Variante nicht nachweisen. Ebenso zeigte ein 19-jähriger nierentransplantierter Patient, der als Homozygote für CYP3A4*26 und inzwischen auch als Homozygote für CYP3A5*3 identifiziert wurde, einen unerwartet hohen Plasmaspiegel von Tacrolimus als Folge einer extrem verminderten Tacrolimus-Clearance (Werk et al., 2014).,
Ähnlich wie CYP3A4*26 hat CYP3A4*30 einen Wechsel von Arginin zu einem vorzeitigen Stop-Codon an Position 130 (Hu et al., 2017). Das Argin wird als wichtig für die Häm-Inkorporation angesehen (Eiselt et al., 2001) und somit würde die Mutation von Arg130 den Häm-Einbau stören und so die Holoenzymexpression von CYP3A4 beeinflussen.
In Kombination mit früheren Studien (Tabelle 3) zeigten einige CYP3A4-Allelvarianten die unterschiedlichen Präferenzen für die Substrate im Gegensatz zu denen der Wildtypenzyme. Einige Varianten weisen nämlich veränderte katalytische Aktivitäten mit einem substratabhängigen Profil auf., Wie oben diskutiert, können widersprüchliche Ergebnisse, die sich aus einem bestimmten Substrat in Studien ergeben, aus vielen Faktoren wie Diskrepanzen von In vitro-oder In-vivo-Verfahren und verschiedenen heterologen Expressionssystemen resultieren.
Chinin hat aufgrund seines engen therapeutischen Index häufige Nebenwirkungen (Bateman und Dyson, 1986). Diese Nebenwirkungen wurden nicht nur durch Medikamente hervorgerufen; Sie wurden auch durch gängige chininhaltige Getränke verursacht., Basierend auf einer systematischen Überprüfung klinischer Daten aus einhundertvierzehn Artikeln machten Nebenwirkungen, die auf chininhaltige Getränke zurückzuführen waren, 20% der gesamten Nebenwirkungen auf Chinin aus (Liles et al., 2016). Überraschenderweise traten selbst bei minimaler Exposition durch übliche Getränke bei einigen Personen schwere Nebenwirkungen auf, die mehrere Organsysteme betrafen. Angesichts der offensichtlichen interindividuellen Vielfalt der Chininempfindlichkeit kann eine Variation der CYP3A4 ein möglicher Mechanismus sein, der chininempfindlichen und nachteiligen Wirkungen zugrunde liegt., Darüber hinaus wurden in einigen Ländern keine Vorschriften für die Verwendung von Chinin festgelegt, z. B. Pillen, die 50 mg oder weniger Chinin enthalten, gelten als natürliches Gesundheitsprodukt und sind in Kanada ohne Rezept erhältlich (Liles et al., 2016); Chininhaltige Lotionen und Shampoos sowie chininhaltige Getränke bleiben allgemein verfügbar und eine Überwachung ist nicht erforderlich. Daher wird ein verstärktes Bewusstsein für interindividuelle Unterschiede in der Chininempfindlichkeit und Nebenwirkungen von Chinin bei Ärzten und der Öffentlichkeit als notwendig erachtet.