autoanticuerpos antimitocondriales en lupus eritematoso sistémico y su asociación con manifestaciones de la enfermedad

aprobación del estudio

población de pacientes

los sueros humanos probados en este estudio se obtuvieron de un estudio aprobado por el Consejo de ética en investigación de la red de salud Universitaria (REB) de pacientes con LES y APS en Toronto, así como de controles sanos y pacientes con CBP reclutados de CHU de Québec-Université Laval Reb estudios aprobados en la ciudad de Quebec., Los pacientes con LES tenían que cumplir los criterios de clasificación ACR de 1982 para el Les revisados en 199781,82 y los pacientes con APS cumplieron los criterios Sapporo de 1999 para el APS revisados en 200683,84. Para el Les, pacientes consecutivas de la Clínica de Lupus de la Universidad de Toronto (UTLC) fueron abordadas y dieron su consentimiento entre agosto de 2010 y octubre de 2011 para ser parte de un estudio sobre el papel de los ácidos grasos y las enfermedades cardiovasculares en el lupus. Proporcionaron una muestra de sangre y sus datos clínicos anonimizados se vincularon a su bioespecimen., Del mismo modo, los pacientes de APS vistos en la clínica de Reumatología en Toronto fueron abordados siguiendo un procedimiento similar. Todo el bioespecimen restante podría utilizarse para futuros estudios sobre biomarcadores de lupus según el consentimiento de los sujetos originales. Se reclutaron voluntarios sanos de control como parte del estudio sobre marcadores de inflamación si no tenían enfermedades conocidas y no tenían síntomas infecciosos en el momento de la extracción de sangre. La edad y el sexo fueron recogidos en ese momento. Los pacientes con PBC cumplieron los criterios de clasificación de PBC de 2009, revisados en 201838, 85, incluida la positividad para anticuerpos anti mitocondriales.,

datos de laboratorios clínicos

para los pacientes con LES, los anti-adnd se midieron mediante el ensayo Farr (corte de laboratorio del 30%) y los anti-cardiolipina (corte de laboratorio de IgG e IgM de 40 unidades GPL o MPL) se midieron mediante ELISA en un laboratorio clínico.

cultivo celular

modelo de ratón Inducible de les

Las recomendaciones del Canadian Council on Animal Care fueron seguidas en un protocolo aprobado por el Animal Welfare Committee de la Université Laval., C57BL / 6 J se obtuvieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) y se alojaron en una instalación de animales libre de patógenos específicos Elite-Plus en CHU de Quebec. Se indujeron autoanticuerpos DE LES en estos ratones como se describió previamente63. En resumen, ratones machos de 6-8 semanas de edad recibieron inyecciones intravenosas de 100 µL de ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, EE.UU.) seguidas 24 h más tarde por una inyección intravenosa de 100 µL de lipopolisacárido (LPS de E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, EE.UU.)., Estas inyecciones se repitieron después de 2 y 4 semanas para un total de tres rondas de inmunizaciones y los ratones se desangraron 48 h después de la tercera inmunización. Se utilizaron ratones C57BL / 6 J inyectados i.v. con PBS bajo el mismo esquema como controles.

ética

a lo largo de todo el estudio, se obtuvieron muestras de sangre de pacientes con consentimiento informado. Todos los métodos presentados en este estudio se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes para donantes humanos y murinos.,

aislamiento de mitocondrias

Las mitocondrias se aislaron de los hígados de ratones C57BL / 6 J siguiendo una combinación de protocolos publicados61,62. Se sacrificaron ratones por dislocación cervical, se extirpó rápidamente el hígado, se extirpó la vesícula biliar y se enjuagó el hígado en PBS heladas (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Luego se picó el hígado y se transfirió a un molinillo de vidrio/Tejido de teflón preenfriado que contenía 12 mL de tampón de aislamiento mitocondrial frío (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM sacarosa) por gramo de hígado, luego se molió hasta obtener una suspensión homogénea. Células y núcleos intactos fueron granulados dos veces a 700 g, 4 ° C, 10 min. Las membranas contaminantes, las proteínas y los orgánulos se eliminaron mediante dos centrifugaciones a 7.000 g, 4 °C, 10 min seguidas de una centrifugación a 10.000 g, 4 °C, 10 min., La suspensión mitocondrial bruta se purificó posteriormente mediante ultracentrifugación contra un gradiente de Percoll (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% V:V Percoll) a 95.000 g, 4 °C, 30 min. La banda que contenía mitocondrias fue recolectada en PBS. Un enfoque similar se utilizó para aislar las mitocondrias humanas con la excepción de que hasta 107 células Hep-G2 fueron lisadas por pasajes repetidos a través de una aguja de calibre estrecho., El kit comercial QIAgen Qproteome (QIAGEN, Hilden, Alemania) también se utilizó, siguiendo las instrucciones del fabricante, para aislar mitocondrias de células Hep-G2 para la comparación de calidad por Western blotting con el protocolo mencionado anteriormente. Las mitocondrias aisladas se dosificaron mediante el método del ácido bicinchonínico (BCA) utilizando el Kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, EE. Las mitocondrias recién aisladas se utilizaron en todos los experimentos con la excepción de las preparaciones de partículas submitocondriales para las cuales las mitocondrias peletizadas se mantuvieron a -80 °C hasta que se necesitaran.,

preparación de partículas Submitocondriales (SMP)

Las SMP se prepararon como se describe en otro lugar60. Brevemente, las mitocondrias congeladas se descongelaron a temperatura ambiente y se diluyeron a 10 mg de proteínas mitocondriales en ácido 4-Morfolinepropanosulfónico (MOPS) de 10 mm. Las muestras se sonicaron con un Dismembrador Fisher Sonic Modelo 500 (Thermo Scientific) al 20% de salida máxima durante 20 segundos y luego se mantuvo en un baño de agua salada durante 10 minutos. Este ciclo se repitió nueve veces., Las muestras se centrifugaron a 16.000 g, 4 ° C, 10 minutos para descartar mitocondrias intactas y otros residuos no deseados. Los sobrenadantes se recogieron en un tubo fresco y sus volúmenes se ajustaron a 2 mL en mopas de 10 mm. Las muestras se ultracentrifugaron a 150.000 g, 4 °C durante 45 minutos. Se resuspendió el SMP granulado en tampón SMP (manitol de 225 mM, sacarosa de 75 mM, HEPES de 10 mM, EDTA de 0,1 mM, pH de 7,4) y se dosificó. Las preparaciones de SMP se mantuvieron a -80 ° C hasta que fue necesario.,

preparación de micropartículas de glóbulos rojos (RBCMP)

se aislaron glóbulos rojos (RBC) de la sangre de voluntarios humanos sanos mediante centrifugación a 282 g durante 10 minutos en RT. se descartaron el plasma rico en plaquetas y la capa buffy, y se mantuvo la fracción de RBC. Se contaron glóbulos rojos (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) y se ajustaron a una concentración de 5 × 108 células/mL en el tampón de Tyrode (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM glucosa, 10 mM HEPES, pH 7,4)., Se diluyeron 109 células en 45 mL de agua doble destilada y se incubaron durante 5 minutos. La tonicidad del tampón se equilibró mediante la adición de 5 ml de PBS 10X (filtrado a través de una membrana de 0,22 µm). El remanente de glóbulos rojos se eliminó por centrifugación a 1.300 g durante 5 minutos en RT y el sobrenadante se centrifugó a 18.000 g durante 90 minutos a 18 ° C. Luego se suspendió el pellet de micropartículas de glóbulos rojos en 500 µl de PBS. La concentración de proteínas se midió con el ensayo BCA.,

Western blotting

medición del tamaño mitocondrial mediante dispersión dinámica de luz (DLS)

el tamaño de las mitocondrias aisladas se midió mediante DLS, utilizando un dispositivo Zetasizer Nano ZS (Malvern instruments, Malvern, Reino Unido) equipado con el láser He-Ne estándar de 4 mW y 633 nm como fuente de luz, establecido en un ángulo de detección de 173°. Los experimentos se replicaron tres veces en cubetas UV desechables de 1 cm de longitud (Brand GMBH, Wertheim, Alemania) que contenían 100 µL de mitocondrias murinas aisladas diluidas en PBS a una concentración de 10 µg de proteínas/µL., Al medir el tamaño mitocondrial se tuvieron en cuenta los siguientes parámetros: índice de refracción del disolvente: 1.330, viscosidad de la muestra: 0.8872 amps, índice de refracción de las proteínas: 1.45, temperatura: 25 °c.

microscopía electrónica

Las mitocondrias (108) se fijaron en acroleína al 3.5% durante 15 min a temperatura ambiente. Las muestras fijas se enjuagaron dos veces en PBS y luego se incrustaron en agarosa al 4%. Se cortaron secciones de 50 µm con un vibratomo, post-fijo en tetroxuro de osmio al 1% durante 30 minutos e incrustado en resina Durcupan., Se visualizaron secciones ultrafinas de setenta nanómetros a 80 kV utilizando un microscopio electrónico de transmisión Tecnai G2 Spirit BioTWIN (Fei, Hillsboro, OR, USA).

evaluación del consumo de oxígeno mitocondrial

Las mitocondrias se resuspendieron en solución de ensayo mitocondrial (MAS: sacarosa de 70 mM, manitol de 220 mM, KH2PO4 de 10 mM, MgCl2 de 5 mM, HEPES de 2 mM, EGTA de 1 mM y ASC libre de ácidos grasos al 0,2%(P/v), pH de 7,4 a 37 °C) y se complementaron con piruvato de 10 mM, malato de 2 mM y FCCP de 4 µM , pH 7,4. Se sembró un equivalente de 10 µg de proteínas en placas XF-96 (Agilent, Santa Clara, CA, EE.UU.)., Las placas se centrifugaron 2.000 g durante 20 min a 4 °C. visualizamos la distribución de las mitocondrias bajo un microscopio de campo brillante para garantizar la adherencia y la repartición homogénea. Las placas se mantuvieron a 37 °C sin CO2 durante aproximadamente 40 minutos antes de la carga. Las tasas de consumo de oxígeno (OCR) se midieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Agilent/Seahorse Bioscience). Los experimentos fueron replicados en tres pozos y promediados para cada condición experimental., Se realizó un total de 3 mediciones del consumo de oxígeno para cada condición aproximadamente cada 6 minutos en condiciones basales y después de la adición secuencial de rotenona (2 µM), succinato (10 mM), antimicina a (40 µM) y TMPD (n,N,N’,n’-tetrametil-p-fenilendiamina)/ascorbato (100 µM/10 mM). El succinato fue utilizado como donante de electrones para el complejo II, la Rotenona como inhibidor del complejo i, la antimicina a como inhibidor del complejo III y la respiración a través del complejo IV fue medida usando TMPD / ascorbato.,

citometría de flujo de alta sensibilidad

debido a su pequeño tamaño, las mitocondrias Fueron detectadas por citometría de flujo de alta sensibilidad, utilizando una «opción de partículas pequeñas» que consiste en una dispersión hacia adelante (FSC) acoplada a un tubo fotomultiplicador (PMT) montado en un producto de Investigación de orden especial BD FACS Canto II (SORP, BD Biosciences). Las mitocondrias (0,5 µg) se teñieron con 1 µg de anti-TOMM22-Atto 488 (clon IC9-2, Sigma-Aldrich) y 1 µM de mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) durante 30 minutos a 37 °C y se diluyeron con PBS hasta un volumen final de 500 µl antes del análisis de citometría de flujo., Para medir cuantitativamente el número de mitocondrias, utilizamos microesferas de poliestireno de 3 µm de diámetro (Polysciences, PA, USA). Se agregaron 80.000 microesferas a cada muestra y se adquirieron 500 microesferas. Se utilizaron partículas de sílice (Kisker Biotech, Steinfurt, Alemania) para determinar la escala de tamaño de 100-1.000 nm.

extracción de ADN mitocondrial por lisis alcalina

Las mitocondrias aisladas fueron peletizadas a 10.000 g, 4 °C, 10 min y resuspendidas en tampón de aislamiento a de 0,8 mL de ADNmt por cada 3 mg de proteínas mitocondriales., Las mitocondrias fueron luego lyzed en un volumen (V: v) mtDNA tampón de aislamiento B (preparado extemporáneamente. 0,2 M NaOH, 1% SDS) durante 3 min. en hielo, bajo agitación suave. las suspensiones de ADNmt se neutralizaron con un tampón de aislamiento de ADNmt de un volumen (v:v) C (acetato de potasio de 1,32 M, pH 4,8 ajustado con ácido acético frío) durante 5 min. en hielo, bajo agitación suave. Mitocondrial escombros fueron peletizado por centrifugación durante 10 minutos a 14.000 g, RT. Los sobrenadantes fueron transferidos a tubos. el ADNmt se precipitó durante la noche a -20 ° C con 0.,1 Volumen (V: v) de acetato de potasio (solución madre:3 m de acetato de sodio, pH ajustado a 5,2 con ácido acético helado) y 0,7 volumen (V: v) de isopropanol absoluto. el ADNmt fue peletizado a 14.000 g, lavado tres veces con 1,5 mL de etanol al 70% y resuspendido en tampón de resuspensión de ADN (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). La concentración de ADN mitocondrial fue determinada por espectrofotometría (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).

aislamiento de núcleos de hepatocitos de ratón

se aislaron núcleos de hígados de ratón mediante métodos publicados86., Brevemente, durante los protocolos de aislamiento de mitocondrias, mientras que los sobrenadantes se utilizaron para realizar aislamientos de mitocondrias, los pellets de la primera centrifugación de 700 g se resuspendieron en 10 mL de tampón de aislamiento de núcleos helados a (5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 mM sacarosa. pH 7,4) y molido en un molinillo de vidrio/teflón previamente enfriado. La suspensión se interrumpió aún más por tres pasajes a través de una aguja de calibre 25 G5/8, seguidos de dos pasajes a través de una aguja de calibre 27 g½., Luego, la suspensión se filtró contra un colador de células de nylon de 40 µM (Thermo Fisher Scientific) y se centrifugó a 600 g, 4 °c, 10 min. Los Pellets se resuspendieron en 14 mL de tampón A y se centrifugaron a 600 g, 4 ° C, 10 min. Los Pellets se resuspendieron en 9 volúmenes de tampón B de aislamiento de núcleos helados (1 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 2,0 M de sacarosa. pH 7,4) y centrifugado a 16.000 g, 4 ° C, 30 min. Los Pellets se resuspendieron en 200 µL de PBS y se almacenaron a -20 °C.,

aislamiento de células enteras y ADN nuclear

se extrajo ADN de 25 mg de hígado entero de ratón o de 200 µL o núcleos aislados utilizando QIAmp ® DNA Mini Kit (QIAgen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron lavadas en el ADN tampón de resuspensión.,

enriquecimientos de ADN mitocondrial y ADN nuclear mediante qPCR

treinta nanogramos de ADN mitocondrial, ADN nuclear o la misma cantidad de ADN total extraído de hígado de ratón entero utilizando los protocolos antes mencionados, fueron amplificados en un rotor-gen Q real time qpcr cycler (QIAgen) según protocolos estándar con SsoAdvanced universal SYBR® Green Supermix (BioRad) en un volumen de reacción de 10 µL., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,

digestión del ADN mitocondrial por enzimas de restricción

el ADNmt purificado de ratón fue digerido por endonucleasas de restricción Hae II o Pst I (Neb, Whitby, ON, Canadá) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los productos digeridos (1,5 µg) se resolvieron con un gel de agarosa al 0,5% (p/v). Las imágenes se obtuvieron en un sistema de documentación Chemidoc MP gel (Bio-Rad). El gel completo se presenta en la Fig. 6d.,

tratamiento con nucleasa S1 de ADN mitocondrial y ADN nuclear

30 µg de ADNmt y adnn se diluyeron en 200 µL de 1x S1-buffer y se trataron con nucleasa S1 de 50 U (Thermo Fischer Scientific) durante 5 minutos a 37 °C. La reacción se detuvo mediante la adición de EDTA de 600 mM (concentración final) y la incubación a 70 °C durante 10 minutos. Las muestras se precipitaron mediante la adición de acetato de sodio de 300 mM (concentración final) y 2 volúmenes (V:v) de etanol absoluto durante 16 horas a -20 °C., Las muestras fueron granuladas a 14.000 g, RT, 20 minutos, y lavadas 1 mL de etanol al 70% y resuspendidas en tampón de resuspensión de ADN. Para los ensayos de competición, el adnn y el ADNmt no tratados siguieron el mismo tratamiento sin adición de la enzima. Las muestras fueron dosificadas por qPCR.

oxidación de las mitocondrias in vitro

Las mitocondrias dosificadas fueron granuladas y resuspendidas a una concentración de 1,5 mg de proteínas mitocondriales / mL en PBS que contenían 500 µM del Hidroperóxido de tercbutilo oxidante (Tbhp) (Sigma-Aldrich)., Las mitocondrias se oxidaron durante 1 h 30 min a 37 °C bajo agitación suave y luego se enjuagaron dos veces con PBS helado. Las mitocondrias oxidadas fueron posteriormente cuantificadas por BCA.

oxidación lipídica mitocondrial

se evaluó la formación de sustancias reactivas de ácido Tiobarbitúrico (TBARS), utilizando el kit de parámetros TBARS (R & D systems, Minneapolis, MN, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se lisaron doscientos microgramos de mitocondrias, las proteínas se precipitaron con ácido tricloroacético (TCA) y se peletearon a 12.000 g, a temperatura ambiente, 4 min., Los sobrenadantes se transfirieron a tubos frescos. Las muestras (75 µL) se incubaron con 37,5 µL de ácido tiobarbitúrico en una placa de 96 pocillos durante 3 h a 50 °C. Las absorbancias se leyeron a 532 nm en un lector de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. Las muestras oxidadas se compararon con las mitocondrias de control que se incubaron en las mismas condiciones en PBS carentes de TBHP.,

oxidación de proteínas mitocondriales

la formación de mitades de carbonilo después de la oxidación mitocondrial in vitro se midió utilizando el kit de ensayo de contenido de proteína de carbonilo (Sigma Aldrich) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras oxidadas se compararon con las mitocondrias de control que se incubaron en las mismas condiciones en PBS carentes de TBHP.,

detección de anticuerpos dirigidos a epítopos mitocondriales mediante ELISA

para la detección de anticuerpos anti-mitocondriales enteros (AwMA), las mitocondrias murinas se diluyeron (500 µg/mL) en tampón de carbonato / bicarbonato de 50 mM, pH 9,6 y 25 µL por pocillo se cargaron en microplacas de poliestireno de fondo plano transparente de media área de 96 pocillos (Corning, Nueva York, EE. Las placas fueron recubiertas durante 18 h a 4 °C y bloqueadas durante 4 h a 37 ° C con PBS conteniendo 10% de FBS y 0,5% de gelatina. Después de tres lavados con PBS, sera diluyó 1:150 (a menos que se especifique lo contrario) en PBS-10% FBS-0.,La gelatina al 3% se incubó durante la noche a 4 °C por duplicado. Después de tres lavados con PBS, las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con fosfatasa alcalina-(AP) conjugada de cabra anti-ratón o IgG anti-humana (Sigma-Aldrich) diluida 1:1,000 en PBS-0.4% de albúmina sérica bovina (ASC). Las placas se lavaron tres veces con PBS y se desarrollaron con fosfato de P-nitrofenol (P-NPP) durante ~30 min a 37 °C y las densidades ópticas (OD) se leyeron a 405 nm en un lector de microplacas., El mismo protocolo se utilizó para la detección de autoanticuerpos dirigidos a partículas submitocondriales mediante el uso de 25 µL por pocillo de SMP diluido (50 µg/mL) en tampón de carbonato/bicarbonato de 50 mM, pH 9,6. Se utilizó un enfoque similar para las mitocondrias humanas con la siguiente modificación: las placas se incubaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humano conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:3,000), la actividad de la peroxidasa se reveló a temperatura ambiente durante ~5 min con 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB). La reacción se detuvo con 2 N H2SO4 y la ODs se leyó a 450 nm., Para el Elisa anti-ADNmt, las placas fueron pre-recubiertas con sulfato de protamina al 1% en agua doble destilada durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS y se cubrieron durante la noche a 4 ° C con 400 ng de ADNmt en PBS. Todos los pasos posteriores fueron idénticos a los utilizados para AwMA-ELISAs. Los valores en blanco (antígenos mitocondriales y sin sueros) se sustrajeron de los valores medidos para cada paciente. Durante el desarrollo de estos ensayos, se probó el recubrimiento adecuado de los pocillos utilizando anticuerpos monoclonales de ratón (mAb) compatibles con isotipos. Un anticuerpo monoclonal (clon IV.,3, 4 µg/mL) se utilizó como control de ensayo negativo en cada caso, mientras que se utilizaron diferentes anticuerpos monoclonales, dependiendo de los antígenos de recubrimiento, como controles de ensayo positivos: un anti-TOMM22 MAB (clon IC9-2, 4 µg / mL. Abcam) para mitocondrias intactas, un anti-ADN mAb (clon 35I9 ADN, 10 µg / mL. Abcam) o un anti-Citocromo C mAb (Clon 7H8.2C12, 5 µg/mL. BD Biosciences).,

ensayo de competencia

AwMA-ELISAs se realizaron como se describe en las secciones anteriores con las siguientes modificaciones: Las muestras de suero se pre-incubaron en tampón de dilución (1:150) con varias concentraciones (0.25, 1 y 3 mg / mL) de competidores (es decir, mitocondrias o micropartículas de glóbulos rojos) durante 3 horas. en RT e incubado por duplicado durante la noche a 4 °C. Los datos se presentan como el porcentaje de señal restante después de cada competencia, en comparación con el OD (405 nm) medido en ausencia de competidores.,

se utilizó un procedimiento similar para AmtDNA-ELISA, utilizando concentraciones aumentadas (0, 3, 9 y 27 ng/µL) de ADN competidor (extraído de núcleos o mitocondrias, con o sin tratamiento con nucleasa S1).

estadísticas

Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando la prueba T de Student, la prueba de Wilcoxon, las pruebas de Friedman o Kruskal-Wallis, ANOVA unidireccional, bidireccional o medidas repetidas ANOVA dependiendo del resultado, así como el número y el tipo de grupos., Cuando se evaluaron comparaciones múltiples, se utilizaron pruebas de corrección post-hoc apropiadas, como Dunn, Dunnett, Sidak o Bonferroni. las asociaciones entre AwMA, AmtDNA y anti-HSP60 se calcularon con correlaciones de Spearman. La distribución de estos anticuerpos según los resultados de ACA se comparó mediante la prueba de Wilcoxon. Las asociaciones entre AwMA o AmtDNA y los resultados clínicos se estudiaron mediante regresiones lineales y logísticas bivariadas y multivariadas., Los resultados clínicos estudiados son espesor medio íntimo promedio, cambio porcentual de la dilatación mediada por flujo (DMF) de la arteria braquial, presencia de DMF, presencia de placa en la carótida, evento trombótico nunca, recuento de glóbulos blancos, recuento de plaquetas, aumento de la unión al ADN por el ensayo Farr por encima del rango normal para el laboratorio de pruebas, presencia de daño según el índice de daño slicc (SDI > 0), alta actividad según la puntuación de actividad SLEDAI-2K (SLEDAI ≥ 4), presencia de nefritis lúpica, clase de biopsia, así como cronicidad e Índice de actividad de la biopsia., Estos últimos se ajustaron en función de la duración de la enfermedad, la edad, el índice de masa corporal (IMC), el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL), la medicación antipalúdica y la prednisona. Las regresiones logísticas se presentan con razones impares y su intervalo de confianza Wald del 95%. Los resultados de los participantes se consideraron positivos para AwMA y AmtDNA cuando su valor estaba por encima del valor de corte identificado después de maximizar el índice de Youden. Se obtuvo un intervalo de confianza del 95% para el corte utilizando 10.000 muestras de bootstrap. Las medidas de desempeño se presentan con su intervalo de confianza exacto del 95%.,

software

Las imágenes Western blot se adquirieron utilizando Image Studio Digits 5.2 (LI-COR biotechnology). la migración del ADNmt a través del gel de agarosa se obtuvo mediante Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). Los estudios de DLS se llevaron a cabo utilizando el software incorporado Zetasizer 7.10 (Malvern Instruments). Las imágenes EM fueron adquiridas con el software de captura de imágenes 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). La citometría de flujo se realizó utilizando el BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biosciences). Los rendimientos de los aislamientos de ADN se cuantificaron utilizando el ND-1000 3.8.,1 software (Thermo Fisher Scientific) y qPCR fueron realizados con RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Las densidades ópticas se midieron utilizando SoftMax Pro 5.4.1 (dispositivos moleculares). Las figuras fueron ensambladas con ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) y Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA). Los análisis estadísticos se realizaron con el software Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) y SAS Versión 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

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