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Discussione
È importante mettere in relazione le variazioni geniche con i fenotipi clinici utilizzando adeguati strumenti di fenotipizzazione dell’attività del CYP3A4. La 3-idrossilazione del chinino è stata dimostrata come reazione di biomarcatore per l’attività del CYP3A4 perché la 3-idrossilazione del chinino è catalizzata dal CYP3A4 sia in vivo che in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Pertanto, i parametri cinetici della catalisi enzimatica sulla chinina 3-idrossilazione sono stati utilizzati come misura dell’attività del CYP3A4 nel presente studio.
Ventitré degli oloenzimi ricombinanti del CYP3A4 hanno mostrato una diminuzione significativa di CLint verso il chinino. Sei varianti, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift) e CYP3A4*21 (Y319C), hanno mostrato un CLint molto più basso per il chinino (1,44–5,80%, Tabella 2) rispetto al CYP3A4 wild-type*1 BIS., Se i nostri risultati in vitro sono replicati in studi clinici, i pazienti portatori di questi alleli possono essere potenzialmente metabolizzatori poveri del CYP3A4 e possono: i) richiedere dosi di chinino più basse per raggiungere concentrazioni plasmatiche terapeutiche; e ii) essere ad aumentato rischio di effetti avversi e tossicità quando vengono utilizzate dosi convenzionali di chinino.
Il CYP3A4*2 (S222P) ha mostrato un CLint ridotto di oltre sei volte (14,76%, Tabella 2) per il chinino rispetto al CYP3A4*1A wild-type., Questa ridotta attività enzimatica potrebbe essere dovuta al fatto che una sostituzione dell’amminoacido serina→prolina potrebbe causare un cambiamento importante nella struttura tridimensionale dell’enzima (è noto che la prolina rompe le alfa-eliche). Allo stesso modo, CYP3A4*2 è stato segnalato per possedere un CLint inferiore per midazolam (Miyazaki et al., 2008), nifedipina (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018), e lidocaina (Fang et al., 2017), rispetto a quello dell’enzima wild-type. Al contrario, CYP3A4 * 2 ha mostrato un CLint più alto per amiodarone (Yang et al., 2019)., Per il testosterone, il CYP3A4 * 2 ha avuto una clearance intrinseca ridotta quando espresso utilizzando il sistema espresso di Escherichia coli in vitro (Miyazaki et al., 2008), ma l’attività era paragonabile all’enzima wild-type quando espresso nel sistema di espressione del baculovirus (Sata et al., 2000) (Tabella 3).
CYP3A4*3 (M445T) ha mostrato una minore attività enzimatica verso il chinino, rispetto all’allele wild-type (Tabella 2)., Il residuo amminoacidico 445 si trova all’interno della regione di legame eme conservata, solo due terminali C amminoacidici al Cys assolutamente conservato nella posizione 442 nella proteina CYP3A4 (Sata et al., 2000); pertanto, un cambiamento Met445Thr può esercitare un effetto sfavorevole sul legame eme, con conseguente alterazione dell’attività catalitica dell’enzima, specialmente quando si lega un substrato adatto. Tuttavia, come indicato nella Tabella 3, l’attività enzimatica del CYP3A4*3 è stata simile a quella del CYP3A4 wild-type per la maggior parte dei substrati testati., La discrepanza dei risultati potrebbe derivare da diversi metodi di espressione eterologa utilizzati e dalla diversa specificità del substrato per la variante.
CYP3A4*4 (I118V) ha mostrato un CLint inferiore verso il chinino, rispetto al CYP3A4*1A wild-type. Studi di mutagenesi diretta al sito suggeriscono che ser119 è un amminoacido chiave implicato come residuo del sito attivo (Yano et al., 2004). Quindi, è probabile che la mutazione Ile118Val influenzi la conformazione del sito attivo, con conseguente diminuzione dell’attività catalitica., Allo stesso modo, uno studio in vivo ha dimostrato che il rapporto tra il livello urinario di 6β-idrossicortisolo/cortisolo libero in questi individui eterozigoti era inferiore a quello nei controlli sani, suggerendo una diminuzione delle attività enzimatiche (Hsieh et al., 2001).
Entrambe le varianti di CYP3A4*8 e *13 mostravano livelli rilevabili, anche se inferiori, di oloproteine di CYP3A4 e avevano attività catalitiche estremamente basse verso il chinino. Contrariamente ai nostri risultati, CYP3A4*8 e *13 sono stati segnalati per non mostrare oloproteine CYP rilevabili quando espresse in sistemi batterici (Eiselt et al., 2001)., Ipotizziamo che l’uso di sistemi di espressione batterica contro insetti possa spiegare i diversi risultati. Il sistema di espressione batterica manca di un ambiente di membrana intracellulare (Gonzalez e Korzekwa, 1995) richiesto per un’elevata espressione di proteine. Al contrario, le cellule degli insetti possono elaborare e modificare le proteine in modo simile alle cellule umane, consentendo il corretto ripiegamento dell’enzima e l’incorporazione del cofattore eme, con conseguente maggiore espressione delle proteine CYP3A4.,
Il CYP3A4*11 (T363M) è stato espresso a livelli significativamente inferiori rispetto al CYP3A4 di tipo selvaggio (Figura 2), un risultato coerente con gli studi che utilizzano sistemi di espressione batterici o di mammiferi (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). La treonina al residuo 363 all’interno del sito di riconoscimento del substrato (SRS)-5 può contribuire alla formazione della rete di legame dell’idrogeno. Una sostituzione da treonina a metionina potrebbe causare la perdita di attività catalitica (Murayama et al., 2002). Quindi CYP3A4 * 11 ha mostrato una ridotta attività di idrossilazione del chinino nello studio attuale., Inoltre, CYP3A4 * 11 ha mostrato una ridotta attività di idrossilazione del testosterone (Murayama et al., 2002), aveva notevolmente aumentato CLint verso lidocaina (Fang et al., 2017) e amiodarone (Yang et al., 2019), ma non è stato associato a cambiamenti evidenti nelle attività metaboliche per ibrutinib (Xu et al., 2018) (Tabella 3).
CYP3A4*12 (L373F) ha mostrato un CLint drasticamente diminuito verso il chinino, in modo simile a un precedente risultato di ricerca verso midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4 * 12 possiede un cambiamento aminoacidico di Leu373Phe; il residuo mutato si trova vicino ad Arg – 372 e Glu-374, che partecipano alla formazione di una rete di legame idrogeno e sono coinvolti in siti attivi secondo studi che coinvolgono la mutagenesi diretta al sito (Yano et al., 2004). Pertanto, è probabile che il residuo mutazionale (L373F) influenzi la stabilità della rete di legame idrogeno e la conformazione spaziale della cavità del sito attivo, con conseguente alterata attività catalitica del CYP3A4*12.,
Il CYP3A4*20 (488 frameshift) ha mostrato una notevole diminuzione dell’espressione dell’apoproteina (Figura 1) e una drastica riduzione del CLint verso il chinino. Al contrario, non sono state riportate attività catalitiche di midazolam 1′- e 4-idrossilazione nei microsomi di lievito o HEK 293 che esprimono CYP3A4 * 20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Questi risultati contrastanti possono essere attribuibili ai diversi sistemi di espressione eterologa e substrati utilizzati negli esperimenti. Inoltre, un eterozigote CYP3A4*20, identificato in individui brasiliani, è stato segnalato per mostrare una ridotta clearance sistemica di ∼1.,9 volte per midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). È stato ipotizzato in precedenza che questa rara mutazione potesse influenzare il ripiegamento delle proteine, l’incorporazione dell’eme (Westlind-Johnsson et al., 2006), e la conformazione spaziale della cavità del sito attivo, dando luogo a una diminuzione o perdita di attività catalitica associata al substrato utilizzato.
CYP3A4 * 21 (Y319C), che è stato identificato nella popolazione cinese (Zhou et al., 2011), ha mostrato una debole attività catalitica nei confronti del chinino nel nostro studio. È interessante notare che nei nostri risultati non è stata identificata alcuna espressione di apoenzima rilevabile., Tyr319 è un residuo altamente conservato nella famiglia del citocromo P450 durante l’evoluzione degli eucarioti da nematode a umano (Zhou et al., 2011). Secondo le previsioni funzionali in silico (Zhou et al., 2011), il residuo di Tyr319 si trova su un dominio importante e una sostituzione di Tyr con Cys alla posizione 319 della proteina CYP3A4*21 può indurre alterazioni drammatiche nella configurazione della cavità del sito attivo. Pertanto, il CYP3A4 * 21 può produrre una proteina malfunzionale con ridotta attività catalitica verso il chinino., Inoltre, abbiamo ipotizzato che questi anticorpi che abbiamo usato per rilevare le apoproteine ricombinanti del CYP3A4 potrebbero non essere adatti per rilevare la variante CYP3A4*21. Cioè, la mutazione di Tyr319Cys in CYP3A4 * 21 può impedire a questi anticorpi di riconoscere gli epitopi specifici in CYP3A4.
Al contrario, due degli oloenzimi ricombinanti del CYP3A4, CYP3A4*15 (R162Q) e CYP3A4*29 (F113I), hanno mostrato un aumento significativo di CLint per il chinino. Allo stesso modo, sia CYP3A4*15 che CYP3A4*29 hanno mostrato un aumento di CLint verso la lidocaina (Fang et al., 2017), ma ha mostrato una diminuzione di CLint per ibrutinib (Xu et al., 2018)., Il CYP3A4 * 15 è stato rilevato per primo in diverse popolazioni etniche con piccoli campioni per ciascun gruppo etnico (Lamba et al., 2002). CYP3A4 * 29 è stato identificato e nominato nel nostro recente studio (Hu et al., 2017). Le due varianti sono correlate al rapido metabolismo del chinino in vitro. Se la conferma di una maggiore clearance del chinino si trova in individui che sono portatori omozigoti o eterozigoti di CYP3A4*29 o CYP3A4*15, questi individui possono essere metabolizzatori ultra-rapidi del chinino CYP3A4., I pazienti con questi genotipi possono: i) avere una minore efficacia terapeutica quando vengono somministrate dosi cliniche usuali di chinino; e ii) richiedere dosi più elevate per raggiungere concentrazioni plasmatiche terapeutiche.
Non sono stati rilevati oloenzimi attivi delle varianti CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop) e CYP3A4*30 (R130Stop) e, di conseguenza, non hanno mostrato alcuna attività metabolica sul chinino (Tabella 2).,
Il CYP3A4*6 ha un’inserzione di un residuo di adenina nell’esone 9 (830-831 insA); questa mutazione causa un frameshift e porta alla traduzione di una proteina troncata che non può incorporare l’eme (Hsieh et al., 2001). Di conseguenza, l’attività catalitica del CYP3A4 * 6 verso il chinino non è stata identificata nel nostro studio. Come mostrato in precedenza in vivo, una persona cinese è risultata eterozigote per il CYP3A4 * 6 con un rapporto molto più basso del livello urinario di 6β-idrossicortisolo:cortisolo libero rispetto agli individui di tipo selvaggio, suggerendo una diminuzione dell’attività del CYP3A4 (Hsieh et al., 2001)., Allo stesso modo, un paziente eterozigote per il CYP3A4*6, sottoposto a trapianto di organi, aveva un rapporto concentrazione-dose aggiustato di tacrolimus 4,3 volte superiore a quello dei pazienti wild-type (Jun et al., 2009).
CYP3A4*26 ha una sostituzione nucleotidica C→T nell’esone 5. Ciò provoca un cambiamento da arginina a un codone di arresto prematuro in posizione 268, e si traduce in una proteina ridotta putativa priva di dominio catalitico e quindi di attività (Werk et al., 2014)., Il CYP3A4 * 26 può non essere espresso a causa del codone di arresto prematuro in posizione 268 o, se lo è, la proteina può essere contrassegnata per una rapida degradazione (Werk et al., 2014). Di conseguenza, non siamo stati in grado di rilevare l’oloproteina della variante CYP3A4*26 espressa nelle cellule Sf21. Allo stesso modo, un paziente trapiantato di rene di 19 anni, identificato come omozigote per CYP3A4*26 e nel frattempo anche un omozigote per CYP3A5*3, ha mostrato un livello plasmatico inaspettatamente elevato di tacrolimus come risultato di una clearance di tacrolimus estremamente ridotta (Werk et al., 2014).,
Simile al CYP3A4 * 26, il CYP3A4*30 ha un cambiamento da arginina a un codone di arresto prematuro alla posizione 130 (Hu et al., 2017). L’Arg130 è considerato importante per l’incorporazione dell’eme (Eiselt et al., 2001) e quindi la mutazione di Arg130 interromperebbe l’incorporazione dell’eme e quindi influenzerebbe l’espressione dell’oloenzima del CYP3A4.
In combinazione con studi precedenti (Tabella 3), alcune varianti alleliche del CYP3A4 hanno mostrato le diverse preferenze per i substrati a differenza di quelli degli enzimi wild type. Vale a dire, alcune varianti presentano attività catalitiche alterate con un profilo dipendente dal substrato., Come discusso sopra, risultati contrastanti derivanti da un substrato specifico negli studi possono derivare da molti fattori come discrepanze dal metodo in vitro o in vivo e diversi sistemi di espressione eterologa.
Il chinino ha frequenti effetti avversi, a causa del suo stretto indice terapeutico (Bateman e Dyson, 1986). Queste reazioni avverse non erano solo indotte da farmaci; erano anche causate da comuni bevande contenenti chinino., Sulla base di una revisione sistematica dei dati clinici di centoquattordici articoli, le reazioni avverse, derivanti da bevande contenenti chinino, hanno rappresentato il 20% delle reazioni avverse totali al chinino (Liles et al., 2016). Sorprendentemente, anche con l’esposizione minuto da bevande comuni, alcuni individui hanno sperimentato gravi reazioni avverse che coinvolgono sistemi di organi multipli. Data l’ovvia diversità interindividuale nella sensibilità al chinino, la variazione del CYP3A4 può essere uno dei possibili meccanismi alla base degli effetti sensibili al chinino e degli effetti avversi., Inoltre, i regolamenti per l’uso del chinino non sono stati stabiliti in alcuni paesi, come le pillole contenenti 50 mg o meno di chinino sono considerate un prodotto naturale per la salute e sono disponibili senza prescrizione medica in Canada (Liles et al., 2016); lozioni e shampoo contenenti chinino, nonché bevande contenenti chinino, rimangono comunemente disponibili e non è richiesta la supervisione. Pertanto, si ritiene necessaria una maggiore consapevolezza delle differenze interindividuali nella sensibilità al chinino e nelle reazioni avverse al chinino tra i medici e il pubblico.