全身性エリテマトーデスにおける抗ミトコンドリア自己抗体および疾患症状との関連

研究承認

患者集団

この研究でテストされたヒト血清は、トロントのSleおよびAPS患者の大学保健ネットワーク研究倫理委員会（REB）承認された研究から得られた。ケベック大学-ケベック–シティにあるラヴァル-レバレッジ大学で学んでいる。, SLE患者は1982年に改訂されたSLEのACR分類基準を満たさなければならず、APS患者は1999年に改訂されたAPSの札幌基準を満たさなければならなかった200683,84。 SLEのために、トロントループスクリニック（UTLC）の大学からの連続した女性患者にアプローチされ、ループスにおける脂肪酸および心血管疾患の役割に関する研究の一部であることをAugust2010とOctober2011の間で同意を提供した。 彼らは一つの血液標本を提供し、彼らの生物種にリンクされた匿名の臨床データを持っていました。, 同様に、トロントのリウマチクリニックで見られるAPS患者は、同様の手順に従って接近した。 残りのすべてのバイオスペシメンは、元の被験者の同意に従ってループスのバイオマーカーに関する将来の研究に使用することができます。 健康な対照ボランティアは、既知の病気がなく、採血時に感染性の症状がない場合、炎症のマーカーに関する研究の一環として募集されました。 年齢と性別はその時に収集されました。 PBC患者は、2009年に改訂されたPBC分類基準を満たし、抗ミトコンドリア抗体の陽性を含む201838,85。,

臨床検査室からのデータ

SLE患者については、Farrアッセイ（30％の実験室カットオフ）を用いて抗dsDNAを測定し、抗カルジオリピン（40GPLまたはMPL単位のIgGおよびIgM実験室カットオフ）を臨床検査室でELISAによって測定した。

細胞培養

Sleの誘導性マウスモデル

カナダ動物ケア評議会の勧告は、Université Lavalの動物福祉委員会によって承認されたプロトコルに従った。, C57BL/6JはJackson Laboratories(Bar Harbor,ME,USA)から入手し、Chu de QuebecのElite-Plus specific-pathogen-free animal facilityに収容した。 Sle自己抗体は、以前に記載されているように、これらのマウスで誘導された63。 簡単に言えば、6-8週齢の雄マウスは、100μlの静脈内注射を受けた2gpi(20μg)(Crystal Chem,Downers Grove,IL,USA)の後、24時間後にリポ多糖(Lps from E.coli,O111:B4;10μg)(Sigma-Aldrich,Saint-Louis,MO,USA)の100μlの静脈内注射を受けた。, これらの注射は、免疫の三ラウンドの合計のための2と4週間後に繰り返され、マウスは、第三の免疫後48時間を出血しました。 同じスケジュールの下でPBSとi.v.を注入したC57BL/6Jマウスは、コントロールとして使用されました。

倫理

研究全体を通じて、血液サンプルは、インフォームドコンセントの下で患者から得られました。 この研究で提示されたすべての方法は、ヒトおよびマウスドナーの両方に関連するガイドラインおよび規制に従って行われた。,

ミトコンドリア単離

ミトコンドリアは、c57bl/6Jマウス公開されたプロトコル61、62の組み合わせに従って肝臓から単離された。 マウスを子宮頸部脱臼によって犠牲にし、肝臓を迅速に除去し、胆嚢を切除し、肝臓を氷冷PBS（137mM NaCl、3mM KCl、19mM Na2HPO4、2mM KH2PO4）ですすいだ。, 次いで、肝臓を細かく刻み、肝臓グラム当たり12mLの氷冷ミトコンドリア分離緩衝液（10mM Tris、1mM EGTA、200mM sucrose）を含む予冷ガラス/テフロン組織粉砕機に移し、次いで均質な懸濁液が得られるまで粉砕した。 無傷の細胞および核を700g、4℃、10分で二度ペレット化した。 汚染膜、タンパク質およびオルガネラは、7,000g、4℃、10分での二つの遠心分離によって除去され、続いて10,000g、4℃、10分での遠心分離によって除去された。, 粗ミトコンドリア懸濁液を、パーコール勾配（10mM Tris、1mM EGTA、30％v：vパーコール）に対する超遠心によって95,000g、4℃、30分でさらに精製した。 ミトコンドリアを含むバンドをＰＢＳに集めた。 同様のアプローチは、107Hep-G2細胞まで狭ゲージ針を通して繰り返し通路によって溶解されたことを除いて、ヒトミトコンドリアを単離するために使用, 市販のキットQIAgen Qproteome（QIAgen、Hilden、Germany）も、製造業者の指示に従って、前述のプロトコルとのwestern blottingによる品質比較のためにHep-G2細胞からミトコンドリアを単離した。 単離したミトコンドリアをＢＣＡ蛋白質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いたビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により投与した。 新たに単離されたミトコンドリアは、ペレット化されたミトコンドリアが必要になるまで-80℃に保たれたsubmitochondrial粒子調製物を除いて、すべての実験で使用,

サブミトコンドリア粒子（SMP）調製

SMPは、他に記載されているように調製した60。 簡単に言えば、凍結したミトコンドリアを室温で解凍し、10ミリメートル4-モルホリンプロパンスルホン酸（MOPS）でミトコンドリアタンパク質のmgに希釈し サンプルは、Fisher Sonic Dismembrator Model500（Thermo Scientific）を使用して20％の最大出力で20秒間超音波処理し、次いで10分間塩氷水浴上に保持した。 このサイクルは九回繰り返された。, 次いで、切れ目のないミトコンドリアおよび他の不要な破片を廃棄するために、サンプルを16,000g、4℃、10分間遠心分離した。 上清を新鮮なチューブに集め、それらの体積を2mLに10mM MOPSで調整した。 次いで、試料を150,000g、4℃で45分間超遠心化した。 ペレット化されたSMPはSMPバッファー（225mMマンニトール、75mMスクロース、10mM HEPES、0.1mM EDTA、pH7.4）に再懸濁し、投与した。 SMP調製物は、必要になるまで-80℃に保たれた。,

赤血球微粒子（RBCMP）調製物

赤血球（RBC）を、282gでRTで10分間遠心分離することにより、健康なヒトボランティアの血液から単離した。血小板に富む血漿およびバフィーコートを廃棄し、RBC画分を保持した。 RBCを計数し（Cellometer Auto M10、Nexcelom Bioscience、Lawrence、MA、USA）、チロード緩衝液中の5×108細胞/mLの濃度に調整し（12mM NaHCO3、127mM NaCl、5mM KCl、0.5mM NaH2PO4、1mM MgCl2、5mMグルコース、10mM HEPES、pH7.4）。, 次いで109個の細胞を45mLの二重蒸留水中で希釈し、5分間培養した。 次いで、緩衝液の張度を、5mlのPBS10Xを添加することによって釣り合わせた（0.22μm膜を通してろ過した）。 残りのRBCを1,300gで室温で5分間遠心分離によって除去し、上清を18,000gで90分間遠心分離し、18℃でRBC微粒子ペレットを次いで500μl PBSに懸濁した。 タンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定した。,

Western blotting

動的光散乱（DLS）によるミトコンドリアサイズ測定

単離されたミトコンドリアのサイズは、標準4mW、633nm He-Neレーザーを光源として備えたZetasizer Nano ZSデバイス（Malvern instruments、Malvern、UK）を用いて、173°の検出角度に設定したDLSによって測定された。 実験は、1cmの長さの使い捨てUVキュベット（Brand GMBH、Wertheim、ドイツ）で100μlの単離されたマウスミトコンドリアをpbsで10μgタンパク質/μlの濃度で希釈したもので三, 溶媒の屈折率：1.330、サンプルの粘度：0.8872mpa、タンパク質の屈折率：1.45、温度：25℃

電子顕微鏡

ミトコンドリア（108）は、室温で3.5％アクロレインに15分間固定 固定されたサンプルは4%のアガロースで埋め込まれたpbsで二度洗われました。 50µmのセクションはvibratomeを使用して切られ、1%の四酸化オスミウムで30分の後固定され、Durcupanの樹脂で埋め込まれました。, 七十ナノメートル超薄切片は、80tecnai G2スピリットBioTWIN（FEI、ヒルズボロ、または、米国）透過型電子顕微鏡を用いて可視化した。

ミトコンドリア酸素消費の評価

ミトコンドリアは、ミトコンドリアアッセイ溶液（MAS：70mMスクロース、220mMマンニトール、10mM KH2PO4、5mM MgCl2、2mM HEPES、1mM EGTAと0.2％（w/v）脂肪酸フリーbsa、pH7.4 37℃）で再懸濁し、10mMピルビン酸、2mMリンゴ酸および4μ m FCCP、pH7.4を補充した。 10μg相当のタンパク質をXF-96プレート（Agilent、Santa Clara、CA、USA）に播種した。, プレートを2,000gで20分間遠心分離した後、4℃で明視野顕微鏡下でミトコンドリアの分布を可視化し、付着と均質な再分割を確実にした。 プレートは、装填の前に37℃でCO2なしで約40分間維持された。 酸素消費率（ＯＣＲ）は、製造業者の説明書（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って測定した。 実験を三つのウェルで複製し，各実験条件について平均化した。, 各条件の酸素消費量の3測定の合計は、基礎条件下で約6分ごとに行われ、ロテノン（2μm）、コハク酸（10mM）、アンチマイシンA（40μm）およびTMPD（N、N、N’、N’-テトラメチル-p-フェニレンジアミン）/アスコルビン酸（100μm/10mM）の順次添加後に行われた。 複合体ＩＩの電子供与体としてこはく酸塩，複合体ｉ阻害剤としてロテノン，複合体ＩＩＩ阻害剤としてアンチマイシンＡを用い，複合体ＩＶを介した呼吸をＴＭＰＤ／アスコルビン酸を用いて測定した。,

高感度フローサイトメトリー

その小さなサイズのために、ミトコンドリアは、BD FACS Canto II特別注文研究製品（SORP、BD Biosciences）に搭載された光電子増倍管（PMT）に結合された前方散乱（FSC）からなる”小粒子オプション”を用いて、高感度フローサイトメトリーによって検出された。 ミトコンドリア（0.5μg）を、1μgの抗TOMM22-Atto488（クローンIC9-2、Sigma-Aldrich）および1μmのmitotracker deep red（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）で30分間、37℃で染色し、フローサイトメトリー分析の前にPBSで最終体積500μl, 定量的にミトコンドリアの数を測定するために、我々は3μ m直径ポリスチレン微小球（Polysciences、PA、米国）を使用しました。 各試料に80,000個の微小球を添加し、500個の微小球を取得した。 シリカ粒子（Kisker Biotech、Steinfurt、Germany）を用いて、100-1,000nmのサイズスケールを決定した。

アルカリ溶解によるミトコンドリアDNA抽出

単離されたミトコンドリアは、10,000g、4°C、10分でペレット化され、0.8mL mtDNA単離バッファーaに3mgのミトコンドリアタンパク質ごとに再懸濁された。, 次いで、ミトコンドリアを一容積（ｖ：ｖ）ｍｔｄｎａ単離バッファＢ（即時調製した。 0.2M NaOH、1%SDS)を3分間投与した。 氷の上で、穏やかな攪拌の下で。 mtDNA懸濁液を一容積（v：v）mtDNA単離緩衝液C（1.32M酢酸カリウム、pH4.8氷冷酢酸で調整）で5分間中和した。 氷の上で、穏やかな攪拌の下で。 ミトコンドリア破片を10分間遠心分離により14,000gでペレット化し、室温で上清を新鮮なチューブに移した。 mtDNAを-20°Cで0で一晩沈殿させた。,1体積（v：v）酢酸カリウム（原液：3m酢酸ナトリウム、氷冷酢酸でpHを5.2に調整）および0.7体積（v：v）絶対イソプロパノール。 次いで、mtDNAを14,000gでペレット化し、1.5mL70％エタノールで三度洗浄し、DNA再懸濁緩衝液（10mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH8.0）に再懸濁した。 ミトコンドリアDNA濃度は、分光光度法（Nanodrop1000、Thermo Fisher Scientific）によって決定した。

マウス肝細胞からの核分離

核は、公開されたmethods86を用いてマウス肝臓から単離された。, 簡単に言えば、ミトコンドリア単離プロトコル中に、上清は、ミトコンドリア単離を行うために使用されたが、最初の700グラム遠心分離からのペレットは、氷冷核分離バッファAの10ミリリットル（5ミリメートルMgCl2、10ミリメートルトリスHCl、250ミリメートルスクロース）に再懸濁した。 pH7.4)および予備冷却されたガラス/テフロンティッシュの粉砕機の地面。 サスペンションはさらに25G5/8ゲージの針を通る三つの通路によって破壊され、27Gβゲージの針を通る二つの通路によって破壊された。, 次いで、懸濁液を40μmのナイロンセルストレーナー（Thermo Fisher Scientific）に対して濾過し、600g、4℃、10分で遠心分離した。 ペレットを14mLの緩衝液A中に再懸濁し、600g、4℃、10分で遠心分離した。 次いで、ペレットを9体積の氷冷核分離緩衝液B（1mM MgCl2、10mM Tris-HCl、2.0Mスクロース）に再懸濁した。 pH7.4)および16,000g、4°C、30分で遠心分離した。 ペレットを200μl PBSに再懸濁し、-20℃で保存した。,

全細胞および核DNA単離

マウス肝臓25mgまたは200μlまたは単離された核からのDNAを、qiamp®DNA Mini Kit（QIAgen）を用いて、製造業者からの指示に従って抽出した。 試料をＤＮＡ再懸濁緩衝液中で溶出した。,

qPCRによるミトコンドリアDNAおよび核DNA濃縮

上記のプロトコルを用いてマウス肝臓から抽出されたミトコンドリアDNA、核DNAまたは同量の全DNAを、SsoAdvanced Universal SYBR®Green Supermix（BioRad）を用いた標準プロトコルに従って、ローター遺伝子QリアルタイムqPCRサイクラー（QIAgen）で10μlの反応量で増幅した。, Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,

制限酵素によるミトコンドリアDNA消化

精製されたマウスmtDNAを、製造元のプロトコルに従ってHae IIまたはPst I制限エンドヌクレアーゼ（NEB、Whitby、ON、Canada） 次いで、消化された生成物（1.5μg）を0.5％（w/v）アガロースゲル上で分解した。 画像は、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＭＰ ｇｅｌ文書化システム（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）上で取得した。 フルレングスゲルは、補足図に示されています。 6d.,

S1ヌクレアーゼミトコンドリアDNAおよび核DNAの処理

30μgのmtDNAおよびnDNAを200μlの1X S1バッファーで希釈し、50U S1ヌクレアーゼ（Thermo Fischer Scientific）で5分間処理し、37℃で600mM EDTA（最終濃度）の添加によって反応を停止し、70℃で10分間インキュベーションした。 サンプルを300mM酢酸ナトリウム（最終濃度）と2体積（v：v）絶対エタノールを16時間-20℃で添加することによって沈殿させた。, サンプルを14,000g、RT、20分でペレット化し、1mL70%エタノールを洗浄し、DNA再懸濁緩衝液に再懸濁した。 競合アッセイのために、未処理のnDNAおよびmtDNAは、酵素の添加なしで同じ処理に続いた。 試料をｑｐｃｒによって投与した。

in-vitroでのミトコンドリア酸化

投与されたミトコンドリアは、ペレット化され、1.5mgのミトコンドリアタンパク質/mLの濃度で500μmの酸化剤テルトブチルヒドロペルオキシド（TBHP）（シグマ-アルドリッチ）を含むPBSで再懸濁した。, ミトコンドリアは、穏やかな攪拌下で1時間30分37℃で酸化され、氷冷PBSで二度すすがれた。 酸化ミトコンドリアはその後、BCAによって定量された。

ミトコンドリア脂質酸化

チオバルビツール酸反応性物質（TBARS）の形成を、製造業者の指示に従って、TBARSパラメーターキット（R&D systems,Minneapolis,MN,USA） ミトコンドリアの二百マイクログラムを溶解し、タンパク質をトリクロロ酢酸（TCA）を用いて沈殿させ、12,000g、室温、4分でペレット化した。, 上清を新鮮な管に移した。 サンプル(75μl)を37.5μlのチオバルビツール酸と96ウェルプレート中で3時間50℃でインキュベートし、吸光度を532nmでSpectraMax190マイクロプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)で読み取り、TBARS定量はキットに提供される標準曲線を用いて行った。 酸化試料をＴＢＨＰを欠いているＰＢＳにおいて同じ条件下でインキュベートした対照ミトコンドリアと比較した。,

Mitochondrial protein oxidation

in-vitroミトコンドリア酸化後のカルボニル部分の形成は、製造業者の指示に従ってProtein Carbonyl Content Assay Kit（Sigma Aldrich）を用いて測定した。 酸化試料をＴＢＨＰを欠いているＰＢＳにおいて同じ条件下でインキュベートした対照ミトコンドリアと比較した。,

ELISAによるミトコンドリアエピトープを標的とする抗体の検出

抗ミトコンドリア全体抗体（AwMA）の検出のために、マウスミトコンドリアを希釈した（500μg/mL）50mMの炭酸/重炭酸塩バッファーで、pH9.6および25μl/ウェルを96ウェル半面積明確な平底ポリスチレン高結合マイクロプレート（Corning、New York、USA）にロードした。 プレートを18時間4℃でコーティングし、次いで4時間37℃で10％FBSおよび0.5％ゼラチンを含有するPBSでブロックした。 PBSで三回洗浄した後、血清を1:150（特に指定のない限り）pbs-10％FBS-0で希釈した。,3%ゼラチンを4°Cで一晩インキュベートした。 PBSで三つの洗浄後、プレートは、アルカリホスファターゼ（AP）共役ヤギ抗マウスまたは抗ヒトIgG（シグマ-アルドリッチ）希釈1：1,000PBS-0.4％ウシ血清アルブミン（BSA） プレートは、PBSで三度洗浄し、p-ニトロフェノールリン酸（p-NPP）で-30分37℃で開発され、光学密度（OD）は、マイクロプレートリーダー上の405nmで読み取られました。, 同じプロトコルは、25mM炭酸/重炭酸バッファー、pH9.6希釈SMPのウェル当たり50μl（50μg/mL）を使用してsubmitochondrial粒子を標的とする自己抗体の検出に使用されました。 プレートは、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗ヒトIgG二次抗体（1：3,000）でインキュベートした、ペルオキシダーゼ活性は-5分の室温で3,3’、5、5′-テトラメチルベンジジン（TMB）で明らかにされた。 反応を2N H2SO4で停止させ、ODsを450nmで読み取った。, 抗mtDNA ELISAのために、プレートは室温で1時間二重蒸留水中で1％硫酸プロタミンでプレコートされた。 プレートをPBSで三回洗浄し、4℃でpbs中の400ng mtDNAで一晩コーティングした。 以降のすべてのステップは、AwMA-ELISAsに使用されたステップと同じでした。 ブランク値（ミトコンドリア抗原および血清なし）は、各患者の測定値から差し引かれた。 これらの試金の開発の間に、井戸の適切なコーティングはisotype一致させたマウスのmonoclonal抗体(mAb)を使用してテストされました。 モノクローナル抗体（Clone IV.,3,4μg/mL）を各例における陰性検定対照として使用し、異なるモノクローナル抗体を、被覆抗原に応じて陽性検定対照として使用した：抗TOMM22mAb（クローンIC9-2,4μg/mL）。 Abcam）無傷のミトコンドリアのために、抗DNA mAb（クローン35I9DNA、10μg/mL。 Abcam）または抗シトクロムC mAb（クローン7H8.2C12,5μg/mL。 ＢＤバイオサイエンス）。,

競争アッセイ

AwMA-ELISAsは、以下の変更と前のセクションで説明したように行われた：血清サンプルは、希釈バッファー（1：150）でプレインキュベートされた様々な濃度（0.25、1および3mg/mL）の競合他社（すなわちミトコンドリアまたは赤血球の微粒子）の3時間。 RTでおよび4℃で一晩重複してインキュベートされたデータは、競合他社の不在下で測定されたOD（405nm）と比較して、各競技後に残るシグナルの割合として,

同様の手順をAmtDNA-ELISAに使用し、競合DNA（核またはミトコンドリアから抽出された、S1ヌクレアーゼ処理の有無にかかわらず）の濃度の増加（0、3、9および27ng/μl）

統計

グループ間の比較は、結果に応じてStudentのt検定、Wilcoxon検定、Friedman検定またはKruskal-Wallis検定、一方向ANOVA、双方向ANOVAまたは反復測定ANOVA、ならびにグループの数およびタ, 多重比較が評価されたとき、Dunn、Dunnett、SidakまたはBonferroniのような適切な事後補正テストが使用された。AwMA、AmtDNAおよび反HSP60間の関連付けはSpearman相関を用いて計算された。 ＡＣＡ結果によるこれらの抗体の分布をＷｉｌｃｏｘｏｎ試験を用いて比較した。 AwMAまたはAmtDNAと臨床転帰との間の関連付けは、二変量および多変量線形およびロジスティック回帰によって研究された。, 検査室の正常範囲以上のFarrアッセイによるDNA結合の増加、SLICC損傷指数（SDI>0）による損傷の存在、SLEDAI-2K活性スコア（SLEDAI≥4）による高い活性、Sledai-2K活性スコア（SLEDAI≥4）による高い活性である。ループスの腎炎、バイオプシーのクラス、またバイオプシーからの慢性および活動の索引。, 後者は疾患期間，年齢，ボディマス指数（ＢＭＩ），低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール，抗マラリア薬およびプレドニゾンについて調整した。 ロジスティック回帰は、奇数比とその95％Wald信頼区間で提示されます。 参加者の結果は、その値がYouden指数を最大化した後に識別されたカットオフ値を上回っていたときにAwMAおよびAmtDNAに対して陽性であると考えられた。 95%信頼区間10,000ブートストラップサンプルを使用してカットオフを得た。 パフォーマンス測定値には、95%の正確な信頼区間が表示されます。,

ソフトウェア

ウェスタンブロット画像は、Image Studio Digits5.2(LI-COR biotechnology)を使用して取得しました。 アガロースゲルを介したmtDNA移行は、Image Lab6.0.1(Bio-Rad)を使用してイメージングされました。 DLS研究は、内蔵のZetasizer7.10ソフトウェア（Malvern Instruments）を使用して実施されました。 EM画像は、画像捕捉ソフトウェア601.384（Advanced Microscopy Techniques Corp.、Woburn、MA、USA）で取得した。 フローサイトメトリーは、BD FACSDiva（商標）6.1.3（BD Biosciences）を用いて行った。 DNA単離からの収率は、ND-1000 3.8を用いて定量した。,1ソフトウェア（Thermo Fisher Scientific）およびqPCRをRotorGene6.1（Corbett Research/QIAgen）で行った。 光学密度はSoftMax Pro5.4.1(Molecular Devices)を用いて測定した。 図はImageJ1.47(National Institutes of Health,Rockville,MA,USA)およびPhotoshop CS6 13.0(Adobe Systems Inc.)で組み立てられました。、マウンテンビュー、カリフォルニア、米国）。 統計分析は、Prism7ソフトウェア（GraphPad Software Inc. SASバージョン9.4(SAS Institute Inc.、ケーリー、ノースカロライナ州、米国）。

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