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議論
CYP3A4活性の適切な表現型ツールを使用して臨床表現型 キニーネの3-ヒドロキシル化は、キニーネの3-ヒドロキシル化がCYP3A4によってin vivoおよびin vitroの両方で触媒されるため、CYP3A4活性のバイオマーカー反応として証明されていた（Mirghani et al.,2003;Rahmioglu et al., 2011)., したがって、キニーネ3-ヒドロキシル化に関する酵素触媒の速度論的パラメータは、本研究におけるCYP3A4活性の尺度として使用された。
組換えCYP3A4ホロ酵素の二十から三は、キニーネに向かって有意に減少したクリントを示した。 六つの変異体、CYP3A4*8（R130Q）、CYP3A4*12（L373F）、CYP3A4*13（P416L）、CYP3A4*17（F189S）、CYP3A4*20（488フレームシフト）、およびCYP3A4*21（Y319C）は、野生型CYP3A4*1A, 私たちのin vitro所見が臨床試験で複製されている場合、これらの対立遺伝子のキャリアである患者は潜在的にCYP3A4貧しい代謝物質であり、i）治療血漿濃度に達するために低いキニーネ用量を必要とする。ii）キニーネの従来の用量を使用すると、有害作用および毒性のリスクが高くなる。
CYP3A4*2（S222P）は、野生型CYP3A4*1Aと比較してキニーネの六倍以上（14.76％、表2）の減少クリントを示した。, この酵素活性の低下は，セリン→プロリンのアミノ酸置換が酵素の三次元構造に大きな変化を引き起こす可能性があるためであると考えられる（プロリンはαヘリックスを破壊することが知られている）。 同様に、CYP3A4*2は、ミダゾラムに対して低いクリントを有することが報告されている（Miyazaki et al.、2008）、ニフェジピン（Sata et al.,2000;Miyazaki et al.、2008）、イブルチニブ（Xu et al.、2018）、およびリドカイン（Fang et al.,2017)、野生型酵素のそれよりも。 対照的に、CYP3A4*2は、アミオダロンに対してより高いクリントを示した（Yang et al., 2019)., テストステロンについては、CYP3A4*2は、In vitroで大腸菌エクスプレスシステムを用いて発現すると、内因性クリアランスが減少した（Miyazaki et al.,2008)、しかし、活性はバキュロウイルス発現系で発現した場合の野生型酵素に匹敵した(Sata et al.,2000)(表3).
CYP3A4*3(M445T)は、野生型対立遺伝子と比較して、キニーネに向かって低い酵素活性を示した（表2）。, アミノ酸残基445は保存されたヘム結合領域内に位置し、442位のCYP3A4タンパク質の絶対に保存されたCysに二つのアミノ酸C末端だけが位置する（Sata et al.,2000);したがって、Met445Thr変化は、特に適切な基質を結合する場合に、酵素の触媒活性の変化をもたらす、ヘム結合に対して好ましくない効果を発揮する可 しかし、表3に記載されているように、CYP3A4*3の酵素活性は、試験されたほとんどの基質について野生型CYP3A4の酵素活性と同様であった。, 結果の不一致は、使用される異なる異種発現方法から、および変異体に対する異なる基質特異性に起因して生じる可能性がある。
CYP3A4*4(I118V)は、野生型CYP3A4*1Aに比べて、キニーネに向かって低いクリントを示した。部位特異的突然変異誘発の研究は、ser119が活性部位残基として関与する重要なアミノ酸であることを示唆している(Yano et al., 2004). したがって、Ile118Val変異は、活性部位の立体配座に影響を与え、触媒活性の低下をもたらす可能性がある。, 同様に、in vivo研究では、これらのヘテロ接合個体における6β-ヒドロキシコルチゾール/遊離コルチゾールの尿レベルの比が健康な対照よりも低く、酵素活性の低下を示唆していることが示された（Hsieh et al., 2001).
CYP3A4*8と*13変異体は、CYP3A4ホロタンパク質の低いとはいえ、検出可能なレベルを表示し、キニーネに向かって非常に低い触媒活性を持っていた。 我々の結果とは対照的に、CYP3A4*8および*13は、細菌系で発現されたときに検出可能なCYPホロタンパク質を示さないことが報告されている（Eiselt et al., 2001)., 細菌対昆虫発現システムの使用は、異なる結果を説明することができると推測している。 細菌発現システムは、タンパク質の高発現に必要な細胞内膜環境（Gonzalez and Korzekwa、1995）を欠いている。 対照的に、昆虫細胞はヒト細胞と同様の方法でタンパク質を処理および改変することができ、酵素の適切な折り畳みおよびヘム補因子の取り込みを可能にし、CYP3A4タンパク質のより高い発現をもたらす。,
CYP3A4*11(T363M)は野生型CYP3A4(図2)よりも有意に低いレベルで発現しており、細菌または哺乳類の発現系を用いた研究と一致する知見である(Eiselt et al.,2001;Murayama et al., 2002). 基板認識サイト（SRS）内の残基363でスレオニン-5は、水素結合ネットワーク形成に寄与する可能性があります。 スレオニンからメチオニンへの置換は、触媒活性の喪失をもたらす可能性がある（Murayama et al., 2002). だからCYP3A4*11は、現在の研究で減少したキニーネヒドロキシル化活性を表示しました。, さらに、CYP3A4*11は、テストステロンヒドロキシル化活性の低下を示した（Murayama et al.,2002)、リドカインに向かってクリントが著しく増加していた(Fang et al.,2017)およびアミオダロン(Yang et al.、2019）、しかし、イブルチニブの代謝活性の顕著な変化とは関連していなかった（Xu et al.,2018)(表3).
CYP3A4*12(L373F)は、ミダゾラムに対する以前の研究結果と同様に、キニーネに対するクリントが劇的に減少したことを示した(Eiselt et al., 2001)., CYP3A4*12はLeu373Pheのアミノ酸変化を有し、変異残基はarg-372およびGlu-374の近くに位置し、水素結合ネットワークの形成に関与し、活性部位に関与している（Yano et al., 2004). したがって、変異残基（L373F）は、CYP3A4*12の変化した触媒活性で、その結果、水素結合ネットワークと活性部位空間配座の安定性に影響を与える可能性が,
CYP3A4*20（488フレームシフト）は著しく減少したアポタンパク質発現（図1）を示し、劇的にキニーネに向かってクリントを減少させた。 対照的に、ミダゾラム1′-および4-ヒドロキシル化の触媒活性は、酵母またはHEK293CYP3A4*20を発現するミクロソームにおいて報告されていない（Westlind-Johnsson et al., 2006). これらの矛盾する結果は、実験で使用された異なる異種発現系および基質に起因する可能性がある。 さらに、ブラジルの個体で同定されたCYP3A4*20ヘテロ接合体は、≥1の全身クリアランスの減少を示すことが報告されている。,In vivoでのミダゾラムの9倍（Westlind-Johnsson et al., 2006). で想定されたこの珍しい突然変異に影響を及ぼす可能性があタンパク質フォールディング、ヘムを取り(Westlind-Johnsson et al.,2006)、および活性部位空洞の空間的配座は、使用される基質に関連する触媒活性の減少または損失を生じさせる。
中国の集団で同定されたCYP3A4*21(Y319C)(Zhou et al.、2011）、我々の研究ではキニーネに対する弱い触媒活性を示した。 興味深いことに、我々の結果で検出可能なアポ酵素発現は同定されなかった。, Tyr319は、線虫からヒトへの真核生物の進化を通じて、シトクロムP450ファミリーにおける高度に保存された残基である（Zhou et al., 2011). Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ機能予測によると（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．,2011),Tyr319残基は重要なドメイン上にあり、位置319CYP3A4*21タンパク質のCysとTyrの置換は、アクティブサイトキャビティ構成の劇的な変化を誘導する 従って、CYP3A4*21はキニーネの方の減らされた触媒作用の活動の機能不全の蛋白質を作り出すかもしれません。, さらに、我々はCYP3A4組換えアポタンパク質を検出するために使用されるこれらの抗体は、バリアントCYP3A4*21を検出するのに適していないかも すなわち、TYR319CYSのCYP3A4*21における変異は、これらの抗体がCYP3A4における特異的エピトープを認識するのを妨げる可能性がある。
対照的に、組換えCYP3A4ホロ酵素、CYP3A4*15（R162Q）とCYP3A4*29（F113I）の二つは、キニーネのための有意に増加したクリントを表示しました。 同様に、CYP3A4*15およびCYP3A4*29の両方が、リドカインに向かって増加したCLintを示した（Fang et al.、2017）、しかし、イブルチニブに対するCLintの減少を示した（Xu et al., 2018)., CYP3A4*15は、各民族グループのための小さなサンプルを持つ異なる民族集団で最初に検出された（Lamba et al., 2002). CYP3A4*29は、我々の最近の研究で同定され、命名された（Hu et al., 2017). 二つの変異体は、in vitroでのキニーネの急速な代謝に関連している。 CYP3A4*29またはCYP3A4*15のホモ接合体またはヘテロ接合体キャリアである個体において増加したキニーネクリアランスの確認が見つかった場合、これらの個体はキニーネのCYP3A4超急速メタボライザーである可能性がある。, これらの遺伝子型を有する患者は、ｉ）通常の臨床用量のキニーネが投与される場合、より低い治療効果を有する；およびｉｉ）治療血漿濃度に達するため
CYP3A4*6(277frameshift)、CYP3A4*26(R268Stop)、およびCYP3A4*30(R130Stop)変異体の活性ホロ酵素は検出されず、したがって、それらはキニーネに代謝活性を示さなかった（表2）。,
CYP3A4*6は、エクソン9（830-831insA）にアデニン残基が挿入されており、この変異はフレームシフトを引き起こし、ヘムを組み込むことができない切り捨てられたタンパク質の翻訳につながる（Hsieh et al., 2001). その結果、キニーネに向かってCYP3A4*6の触媒活性は、我々の研究では同定されなかった。 以前にin vivoで示されたように、中国の人はCYP3A4*6のヘテロ接合であり、野生型の個体よりも6β-ヒドロキシコルチゾール：遊離コルチゾールの尿レベルの比がはるかに低いことが判明し、CYP3A4活性の低下を示唆している（Hsieh et al., 2001)., 同様に、臓器移植を受けているCYP3A4*6のヘテロ接合である患者は、野生型患者のそれよりも4.3倍高いタクロリムス濃度調整用量比を有していた（Jun et al., 2009).
CYP3A4*26は、エクソン5におけるc→Tヌクレオチド置換を有する。 これは268位のアルギニンから早期停止コドンへの変化を引き起こし、触媒ドメインを欠いていると推定される短縮タンパク質をもたらし、したがって活性をもたらす(Werk et al., 2014)., CYP3A4*26は、268位の早期停止コドンのために発現しないかもしれないか、またはそうである場合、タンパク質は急速な分解のためにマークされ得る（Werk et al., 2014). したがって、我々はCYP3A4*26バリアントSf21細胞で発現のホロタンパク質を検出することができませんでした。 同様に、19歳の腎臓移植患者は、CYP3A4*26のホモ接合体として同定され、一方CYP3A5*3のホモ接合体として同定され、タクロリムスクリアランスが極めて減少した結果、予期せず高い血漿レベルのタクロリムスを示した(Werk et al., 2014).,
CYP3A4*26と同様に、CYP3A4*30は、130位でアルギニンから早期停止コドンへの変化を有する（Hu et al., 2017). Arg130はヘムの取り込みにとって重要であると考えられている（Eiselt et al.,2001)したがって、Arg130の突然変異はヘムの取り込みを妨害し、CYP3A4のホロ酵素の発現に影響を与える。
以前の研究（表3）と組み合わせて、いくつかのCYP3A4対立遺伝子変異体は、野生型酵素のものとは異なり、基質に対する異なる好みを示した。 すなわち、異展示を変更触媒活動の基板依存する。, 上記で論じたように、研究における特定の基質に由来する矛盾する結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ法および異なる異種発現系からの不一致などの多くの要
キニーネは、その狭い治療指数のために頻繁に有害作用を有する（Bateman and Dyson、1986）。 これらの有害反応は、薬物によって誘発されただけでなく、一般的なキニーネ含有飲料によっても引き起こされた。, 百から十四記事からの臨床データに関する体系的なレビューに基づいて、キニーネ含有飲料から生じた副作用は、キニーネに対する全有害反応の20％を占め, 2016). 意外にも、共通の飲料からの分の露出と、何人かの個人は複数の臓器系を含む厳しく不利な反作用を経験しました。 キニーネ感受性の明らかな個人間の多様性を考えると、CYP3A4の変化は、キニーネ感受性および有害作用の根底にある一つの可能なメカニズムであ, さらに、キニーネの使用に関する規制は、50mg以下のキニーネを含む丸薬が自然健康製品とみなされ、カナダで処方箋なしで入手可能であるなど、一部の国,2016);キニーネ含有ローションおよびシャンプー、ならびにキニーネ含有飲料は、一般的に入手可能なままであり、監督は必要とされない。 従って、キニーネの感受性の個人間の相違の高められた意識および医者および公衆間のキニーネへの不利な反作用は必要であると信じられます。