반대로-미토콘드리아 자가에서 조직 lupus erythematosus 및 그들의 협회와 질병 증상
연구 승인
참을성 있는 인구
인간의 혈청 테스트에서 이 연구에서 얻어진대학교 건강 네트워크 연구윤리위원회(REB) 승인한 연구의 루푸스 및 AP 환자에서 토론토에서뿐만 아니라 건강한 통제 및 PBC 환자 모집에서 추 드 퀘벡–Université Laval REB 승인한 연구에서 퀘벡 도시입니다., 루푸스 환자를 충족하는 1982 년 ACR 분류 기준에 대한 SLE 개정 199781,82 및 AP 환자를 만난 1999 년 삿포로에 대한 기준 AP 를 개정 200683,84. SLE,연속 여성 환자에서 토론토 대학의 루푸스 병원(UTLC)접근했다고 사실에 동의한 사 월 2010 월 2011 야에 대한 연구의 일부 지방산의 역할 및 심혈관 질병에 lupus. 그들은 하나의 혈액 표본을 제공하고 그들의 익명화 된 임상 데이터가 그들의 생체 특성과 연결되도록했습니다., 유사하게,토론토의 류마티스 클리닉에서 본 APS 환자는 유사한 절차에 따라 접근되었다. 남아있는 모든 바이오 스펙은 원래 피험자의 동의에 따라 루푸스의 바이오 마커에 대한 향후 연구에 사용될 수 있습니다. 건강 컨트롤 지원자 모집 된 일부분으로의 연구에 마커의 염증이 있다면 그들 알려진 질병을 가지고 있지 않았 전염성 현상이 시간에서의 혈액 그립니다. 그 당시 나이와 성별이 수집되었습니다. PBC 환자는 항 미토콘드리아 항체에 대한 양성을 포함하여 201838,85 에서 개정 된 2009PBC 분류 기준을 충족했습니다.,
에서 데이터를 임상 연구실
루푸스 환자,anti-dsDNA 이용하여 측정하였 Farr assay(실험실 컷오프 30%)및 anti-cardiolipin(IgG 고 IgM–실험실 컷 오프의 40GPL 또는 MPL 단위)를 측정하여 엘리사에서 임상 실험실입니다.
셀 문화
마우스를 유도할 수 있는 모델의 SLE
의 권고 캐나다 위원회에서 동료들에 따라 프로토콜에 의해 승인되는 동물 복지위원회에서 대학교 Laval., C57bl/6J 는 Jackson Laboratories(BAR Harbor,ME,USA)에서 얻었고 Chu De Quebec 의 Elite-Plus 특정 병원체가없는 동물 시설에 보관되었습니다. Sle 자가 항체는 이전에 설명 된대로 이들 마우스에서 유도되었다 63. 에 대한 간략한,6-8 주 된 남자 쥐 받은 100µL i.v. 주입의 ß2GPI(20µg)(크리스탈 Chem,Downers Grove,IL,미국)다음 24 시간 이후에 의해 100µL i.v. 주입의 lipopolysaccharide(LPS 에서 대장균,O111:B4;10µg)(Sigma-Aldrich,Saint-Louis,MO,미국)., 이 주사는 총 3 회의 예방 접종에 대해 2 주 및 4 주 후에 반복되었고,마우스는 세 번째 예방 접종 후 48 시간 동안 피를 흘렸다. 동일한 일정에 따라 PBS 와 함께 i.v.를 주입 한 C57BL/6J 마우스를 대조군으로 사용 하였다.
윤리
통해 전체 연구,혈액 샘플을 환자에서 얻은 정보를 아래에 동의합니다. 이 연구에서 제시된 모든 방법은 인간 및 뮤린 기증자 모두에 대한 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.,
미토콘드리아 분리
미토콘드리아는 출판 된 protocols61,62 의 조합에 따라 C57BL/6J 마우스의 간에서 분리되었다. 쥐들에 의해 희생 자궁 경관 전위,간 신속하게 제거,담낭 절제하고,간이었다로 세척 얼음처럼 차가운 PBS(137mM NaCl,3mM KCl,19mM Na2HPO4,2mM KH2PO4)., 간이었다 그런 다음 다진 및 전송을 미리 냉각되는 유리제/조직 테플론 분쇄기가 포함된 12mL 의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아의 격리 버퍼(10mm Tris,1mM EGTA,자당 200mM)g 의 간 다할 때까지 가는 동종 현탁액을 획득하였다. 손상되지 않은 세포 및 핵을 700g,4℃,10 분에 2 회 펠렛 화 하였다. 오염막,단백질 및 세포기관에 의해 삭제 되었다 두 centrifugations 에서 7,000g,4°C 에 10min 다음 원심분리에서 10,000g,4°C 에 10min., 원유 미토콘드리아의 서스펜션 추가 정제하여 ultracentrifugation 에 대해 Percoll 그라데이션(10mm Tris,1mM EGTA,30%v:v Percoll)에 95,000g,4°C,30min. 미토콘드리아를 함유 한 밴드를 PBS 에서 수집 하였다. 비슷한 접근 방식 사용되었을 격리하려는 인간의 미토콘드리아와 함께하는 예외까지 107Hep G2 셀 lysed 에 의해 반복 구절을 통해 좁은 계기용 바늘입니다., 상업적인 장비 QIAgen Qproteome(QIAgen,Hilden,Germany)도 사용되었,다음과 같은 제조업체의 지침을 격리하기 위해 미토콘드리아에서 Hep G2 세포에 대한 품질의 비교를 서양종 상기 프로토콜입니다. 분리 된 미토콘드리아는 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher scientific,WALTHAM,MA,USA)를 사용하여 bicinchoninic acid(BCA)방법에 의해 투여되었다. 갓 절연 미토콘드리아에서 사용 된 모든 실험은 제외한 submitochondrial 입자를위한 준비는 산탄 미토콘드리아에서 유지되었습니다 -80°C 때까지 필요합니다.,
Submitochondrial 입자(SMP)제조
SMP 는 elsewhere60 에 기재된 바와 같이 제조되었다. 간단히,냉동 미토콘드리아를 실온에서 해동시키고 10mM4-Morpholinepropanesulfonic acid(MOPS)에서 10mg 의 미토콘드리아 단백질로 희석시켰다. 샘플 초음파처리를 한 사용하여 피셔 음 Dismembrator 모델 500(Thermo 과학)20%에서 최대 출력이 20 초 동안 다음에 소금 얼음 물 bath for10minutes. 이 사이클은 9 번 반복되었습니다., 그런 다음 샘플을 16,000g,4°C,10 분 동안 원심 분리하여 깨지지 않은 미토콘드리아 및 기타 원치 않는 파편을 폐기했습니다. 상청액을 신선한 튜브에 모으고 그 부피를 10mm MOPS 에서 2ml 로 조절했다. 이어서 샘플을 150,000g,4°c 에서 45 분 동안 ultracentrifuged 하였다. 펠렛 화 된 SMP 를 SMP 완충액(225mM 만니톨,75mM 수크로오스,10mM 헤페스,0.1mM EDTA,pH7.4)에서 재수용하고 투약 하였다. SMP 준비는 필요할 때까지 -80°C 에서 유지되었다.,
적혈구는 미(RBCMP)준비
빨간 혈구(RBC)으로부터 격리 되었고 혈액의 건강한 인간의 자원 봉사자에 의해 원심분리에서 282g 에서 10 분간 RT. 혈소판이 풍부한 플라즈마 및 버피 코트이 삭제되었고,RBC 분수로 유지됩니다. RBC 었(Cellometer 자동 M10,Nexcelom 생명과학과,Lawrence,MA,미국)및 조정하여 농도의 5×108cells/mL 에 Tyrode 의 버퍼(12mM NaHCO3,127mM NaCl,5mM KCl,0.5mM NaH2PO4,1mM 는 mgcl2,5mM 포도당,10mM HEPES,pH7.4)., 이어서,109 개의 세포를 45mL 이중 증류수로 희석하고 5 분 동안 배양 물 하였다. 그런 다음 완충액의 tonicity 는 5ml 의 PBS10X(0.22-μm 막을 통해 여과)를 첨가하여 균형을 이루었다. 잔 RBC 에서 제거한 원심분리에서 1,300g 에서 5 분간 RT 및 쏟고 있었 centrifugated 에서 18,000g90 분에서 18°C RBC microparticle 펠렛 그 중에서 500µl PBS. 단백질 농도는 BCA 분석법으로 측정 하였다.,
웨스턴 압
미토콘드리아 크기를 측정하여 동적 광산란(DLS)
의 크기 절연 미토콘드리아에 의해 측정되었다 DLS,타사이저를 사용하여 나노 ZS 장치(Malvern instruments,Malvern,영국)을 갖춘 기준 4mW,633nm 그는 네브라스카 레이저 광원으로,설정에서 탐지 각도의 173°. 실험 복제 세 번에 1cm 의 길이가 처분할 수 있는 UV-Cuvettes(브랜드 GMBH,베르트,독일)를 포함하는 100µL 의 격리 murine 미토콘드리아에 희석 PBS 에서 농도의 10µg 단백질/μl., 다음 매개변수로 고려에 따라 측정 크기의 미토콘드리아:의 굴절률의 solvent:1.330 에,점성의 샘플:0.8872mpa,굴절률의 단백질:1.45,온도:25°C
전자 현미경
미토콘드리아(108)고 3.5%아크롤레인 등이 있 15min at room temperature. 고정 된 샘플을 PBS 에서 두 번 헹구어 낸 다음 4%아가로 오스에 내장시켰다. 50μm 섹션을 vibratome 을 사용하여 절단하고 30 분 동안 1%오스뮴 테트록 시드에 후 고정하고 Durcupan 수지에 내장했습니다., 70 나노 미터 초박형 섹션은 Tecnai G2Spirit BioTWIN(FEI,Hillsboro,OR,USA)투과 전자 현미경을 사용하여 80kv 에서 시각화되었습니다.
Assessment 의 미토콘드리아 산소 소비
미토콘드리아었 resuspended 에서 미토콘드리아 분석 솔루션(MAS:70mM 자당,220mM 만니톨,10mM KH2PO4,5mM 는 mgcl2,2mM HEPES,1mM EGTA0.2%(w/v)지방산 무료 BSA,pH7.4 37°C)및 보완 10mM pyruvate,2mM malate4μm FCCP,pH7.4. XF-96 플레이트(Agilent,Santa Clara,CA,USA)에 10μg 단백질의 당량을 시드 하였다., 판 다음 원심 분리 2,000g20 분에서 4°C 로 우리는 시각화의 배포는 미토콘드리아에서 밝은 분야 현미경을 준수하도록 보장하고 균일 다시 분할. 플레이트는 로딩 전에 약 40 분 동안 CO2 없이 37℃에서 유지되었다. 산소 소비율(OCR)은 제조업체 지침(Agilent/Seahorse Bioscience)에 따라 측정되었습니다. 실험은 3 개의 우물에서 복제되었고 각 실험 조건에 대해 평균화되었다., 총 3 개의 측정의 산소 소비를 위해 각각 상태를 만들었다는 약 6 분에서 기초 조건후 순차적 이외의 로테논(2µM),호박(10mM),antimycin A(40µM)및 TMPD(N,N,N’,N’-테트라메틸-p-페닐렌디아민)/Ascorbate(100μm/10mM)입니다. 호박으로 사용되었 전자 기증자에 대한 복잡한 II,로테논으로 복잡한 나 억제제,antimycin 같은 복잡한 III 억제물과 호흡을 통해 복잡한 IV 측정을 사용하여 TMPD/ascorbate.,
높은 감도 cytometry
그들의 작은 크기 때문에,미토콘드리아 발견되었으로 높은 감도 cytometry 를 사용하여,”작은 입자 옵션”로 구성되는 앞으로 분산(FSC)결합하여 광전 증배관(PMT)에 장착된 BD FACS Canto II 특별 주문 연구 제품(SORP,BD 생명 과학). 미토콘드리아(0.5μg)었으로 얼룩진 1µg anti-TOMM22-Atto488(clone IC9-2,Sigma-Aldrich)1μm 의 mitotracker 깊고 빨간(Invitrogen,Carlsbad,CA,미국)30 분 37°C 고 희석 PBS 최종의 볼륨 500µl 기 전에 flow cytometry 분석합니다., 미토콘드리아의 수를 정량적으로 측정하기 위해 3μm 직경의 폴리스티렌 마이크로 스피어(POLYSCIENCES,PA,USA)를 사용했습니다. 80,000 마이크로 스피어를 각 샘플에 첨가하고 500 마이크로 스피어를 획득 하였다. 실리카 입자(Kisker Biotech,Steinfurt,Germany)는 100-1,000nm 크기 스케일을 결정하는 데 사용되었습니다.
미토콘드리아 DNA 를 추출하여 알칼리성 세포의 용해
고립 미토콘드리아었 펠렛에서 10,000g,4°C 에 10 분 resuspended 에서 0.8mL 미토콘드리아 dna 격리 버퍼에 대한 모든 3mg 의 미토콘드리아 단백질이다., 그런 다음 미토콘드리아를 하나의 부피(v:v)에서 lyzed 하였다 mtDNA 분리 버퍼 B(extemporaneously-prepared. 3 분 동안 0.2M NaOH,1%SDS). 얼음 위에서,부드러운 동요 아래. 현탁액을 미토콘드리아 dna 었으로 중화 하나를 볼륨(v:v)미토콘드리아 dna 격리 버퍼 C(1.32M 칼륨 아세테이트,pH4.8 조정과 얼음처럼 차가운 아세트산)에서 5 분. 얼음 위에서,부드러운 동요 아래. 미토콘드리아 파편을 14,000g 에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 펠렛 화하고,Rt.상청액을 신선한 튜브로 옮겼다. mtdna 를 0 으로 -20℃에서 밤새 침전시켰다.,1 볼륨(v:v)칼륨 아세테이트(주식 해결책:3M 나트륨 아세테이트,pH 조정 5.2 로 아세트산)및 0.7 볼륨(v:v)절대 이소프로판올. 이어서,mtDNA 를 14,000g 에서 펠렛 화하고,1.5mL70%에탄올로 3 회 세척하고 DNA resuspension 완충액(10mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH8.0)에서 resuspended. 미토콘드리아 DNA 농도는 분광 광도계(Nanodrop1000,Thermo Fisher Scientific)에 의해 결정되었다.
마우스 간세포로부터의 핵 분리
핵은 게시 된 methods86 을 사용하여 마우스 간에서 분리되었다., 간단히 중 미토콘드리아 isolation 프로토콜,동 supernatants 사용되었을 수행하기 위한 미토콘드리아 isolations,펠릿에서 첫 번째 700g 원심 분리되었 resuspended 에서 10㎖의이 핵의 격리 버퍼(5mM 는 mgcl2,10mm Tris–HCl,자당 250mM. pH7.4)및 사전 냉각 된 유리/테플론 티슈 분쇄기에서 분쇄하십시오. 서스펜션은 더욱 중단에 세 구절을 통해 25G5/8 계기 바늘 다음에 두 개의 구절을 통해 27G½계기용 바늘입니다., 서스펜션었다 그런 다음 필터링에 대해 40µM 나일론 셀 스트레이너(Thermo Fisher Scientific)과 원심 분리에 600g,4°C 에 10min. 펠렛을 14mL 완충액 A 에서 재수용하고 600g,4°C,10min 에서 원심분리하였다. 펠렛은이어서 9 부피의 얼음-차가운 핵 분리 완충액 B(1mM MgCl2,10mM Tris-hcl,2.0M 자당. pH7.4)및 16,000g,4°C,30 분 원심 분리. 펠렛을 200μl PBS 에서 resuspended 하고 -20℃에서 저장 하였다.,
전체 세포와 핵 DNA isolation
DNA 중 하나에서 25mg 의 전체 마우스 간 또는 200µL 또는 고립 핵 사용하여 추출 QIAmp®DNA Mini Kit(QIAgen),다음과 같은 지침을 제조 업체입니다. 샘플을 DNA resuspension buffer 에서 용출시켰다.,
미토콘드리아 DNA 및 핵 DNA 부화에 의해 qPCR
른 나노그램의 mitochondrial DNA,핵 DNA 또는 동일 금액의 총 DNA 를 추출한 전체에서 마우스를 사용하여 간 상기 프로토콜,증폭되었에서 회전자는 유전자 Q 실시간 qPCR 자전거 타는 사람(QIAgen)표준에 따라 프로토콜 SsoAdvanced Universal sybr 그®녹색 수퍼 믹스(된)에서 10µL 반응을 볼륨에 있습니다., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
제한 효소에 의한 미토콘드리아 DNA 소화
정제 된 마우스 mtDNA 는 제조자의 프로토콜에 따라 Hae II 또는 Pst I 제한 엔도 뉴 클레아 제(NEB,Whitby,ON,Canada)에 의해 소화되었다. 소화 된 제품(1.5μg)은 0.5%(w/v)아가 로스 겔에서 해결되었습니다. 이미지는 Chemidoc MP 젤 문서 시스템(Bio-Rad)에서 획득되었습니다. 전장 겔은 보충 도 1 에 제시되어있다. 6 디.,
S1nuclease 치료의 미토콘드리아 DNA 및 핵 DNA
30µg 의 미토콘드리아 dna 및 nDNA 들에 희석한 200µL 의 1X S1-버퍼와 치료 50U S1nuclease(열 피셔는 과학)에서 5 분 동안 37°C 반응에 의해 중단한의 600mM EDTA(최종 농도)및 잠복기에서 70°C 에서 10 분간 방치한다. 샘플 침전 통해 추가의 300mM 나트륨 아세테이트(최종 농도)및 2 개의 볼륨(v:v)절대적인 에탄올에 대한 16 시간 -20°C, 샘플을 14,000g,RT,20 분에 펠렛 화하고,1mL70%에탄올을 세척하고 DNA resuspension 완충액에서 resuspended. 경쟁 분석 결과를 위해,처리되지 않은 nDNA 및 mtDNA 는 효소를 첨가하지 않고 동일한 처리를 따랐다. 샘플은 qPCR 에 의해 투약되었다.
미토콘드리아에서 산화 체외
미토콘드리아 투여했 펠렛 및 resuspended 에서 농도의 1.5mg 의 미토콘드리아 단백질/mL PBS 에서 포함된 500μm 의 산화 tertbutyl hydroperoxide(TBHP)(Sigma-Aldrich)., 미토콘드리아는 온화한 동요의 밑에 37°c 에 1h30 분을 위해 산화한 그 후에 얼음 찬 PBS 로 두번 헹궜습니다. 산화 된 미토콘드리아는 이후 BCA 에 의해 정량화되었다.
미토콘드리아 지질 산화
Thiobarbituric 산 반응성 물질(고)형성 평가를 사용하여,고가의 매개 변수 Kit(R&D 시스템,Minneapolis,MN,미국),제조업체의 지침에 따라. 이백 마이크로 그램의 미토콘드리아를 용해시키고,단백질을 트리클로로 아세트산(TCA)을 사용하여 침전시키고 12,000g,실온,4 분에서 펠렛 화시켰다., 상청액을 신선한 튜브로 옮겼다. 샘플(75μl)were incubated37.5µL 의 thiobarbituric 산에서 96-well 플레이트 3 시간에서 50°C.Absorbances 읽에 532nm 에 SpectraMax190 마이크로플레이트 리더(분자 장치,Sunnyvale,CA,미국)고 고가의 정량화를 사용하여 수행되는 표준곡선에서 제공하는 키트입니다. 산화 된 샘플을 TBHP 가없는 PBS 에서 동일한 조건 하에서 배양 된 대조군 미토콘드리아와 비교 하였다.,
미토콘드리아 단백질 산화
카르보닐기의 형성 moieties 다음과 같은 체외 미토콘드리아 산화 측정을 사용하여 단백질 생성 콘텐츠 Assay Kit(Sigma 알드리치)다음과 같은 제조업체의 지침에. 산화 된 샘플을 TBHP 가없는 PBS 에서 동일한 조건 하에서 배양 된 대조군 미토콘드리아와 비교 하였다.,
항체의 타겟팅을 미토콘드리아 epitopes 해서 ELISA
의 검출을 위한 반대로-미토콘드리아 전체 항체(AwMA),murine 미토콘드리아었 희석(500µg/mL)50mM 탄산/중탄산염 완충기,pH9.6 25µL per well 드에 96-well half-영역을 명확한 평평한 바닥 폴리스티렌 높은 바인딩 microplates(Corning,뉴욕,미국). 플레이트를 4°C 에서 18h 동안 코팅 한 다음 10%FBS 및 0.5%젤라틴을 함유하는 pbs 로 37°c 에서 4h 동안 차단 하였다. Pbs 로 3 회 세척 한 후,혈청은 PBS-10%FBS-0 에서 1:150(달리 명시되지 않는 한)으로 희석되었습니다.,3%젤라틴을 4℃에서 중복으로 밤새 배양 하였다. 후 세척으로 PBS,판 배양을 위한 1 시간에서 온 알칼리인산화효소-(AP)를 활용 goat anti-mouse 또는 반대로 인간의 IgG(Sigma-Aldrich)희석 1:1,000PBS-0.4%소 혈 청 알부민(BSA). 접시 세척 세번으로 PBS 및 개발 p-트로페 놀 인산(p-NPP)에 대한~30min37°C 과 광학적 밀도(OD)읽 405nm 에서 마이크로플레이트 리더입니다., 동일한 프로토콜을 사용에 대한 탐지의 대상으로 하는 자가 submitochondrial 입자를 사용하여 25µL per well SMP 희석(50μg/mL)50mM 탄산/중탄산염 완충기,pH9.6. 비슷한 접근을 위해 사용되었 인간에 미토콘드리아는 다음과 같이 수정:판 배양되었으로 고추냉이 과산화효소 활용 anti-인 IgG 보조 항체(1:3,000),과산화효소 활동에서 밝혀졌 상온~5 분 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(TMB). 반응은 2N H2SO4 로 중단되었고 ods 는 450nm 에서 판독되었다., 안티-mtDNA ELISA 를 위해,플레이트를 실온에서 1 시간 동안 이중 증류수에서 물 1%프로타민 설페이트로 미리 코팅 하였다. 플레이트를 PBS 로 3 회 세척하고 pbs 에서 400ng mtDNA 로 4°c 에서 밤새 코팅 하였다. 모든 후속 단계는 AwMA-ELISAs 에 사용 된 단계와 동일했습니다. 빈 값(미토콘드리아 항원 및 혈청 없음)은 각 환자에 대해 측정 된 값으로부터 뺐다. 이러한 분석법을 개발하는 동안,우물의 적절한 코팅은 isotype-matched mouse monoclonal antibodies(mAb)를 사용하여 시험되었다. 단일 클론 항체(클론 IV.,3,4µg/mL)을 사용하였으로 부정적인 분석 결과 제어에 각각의 인스턴스는 다른 단일 클론항체를 사용되었에 따라,코팅 항원으로 긍정적인 분석트:안티-TOMM22mAb(Clone IC9-2,4µg/mL. Abcam)손상되지 않은 미토콘드리아의 경우,항 DNA mAb(클론 35I9DNA,10μg/mL. Abcam)또는 항-시토크롬 C mAb(클론 7H8.2C12,5μg/mL. BD 생물 과학).,
경쟁 분석
AwMA-ELISAs 수행되었으로 이전 섹션에서 설명과 함께 다음과 같이 수정:혈청 샘플 pre-배양에 희석 버퍼(1:150)스파이크로 여러 농도(0.25,1,3mg/mL)의 경쟁자(예:미토콘드리아 또는 적혈구는 미립자)3 시간입니다. 에 RT 및 배양에서의 중복은 하룻밤에서 4°C 로의 데이터가 제시 비율로 신호의 잔여 각 경쟁 후에 비해 OD(405nm)측정의 부재에서 경쟁자.,
비슷한 절차를 위해 사용되었 AmtDNA-ELISA,사용 농도가 증가(0,3,9 월 27 일 ng/μl)의 경쟁 DNA(에서 추출한 핵 또는 미토콘드리아와 함께 또는없이 S1nuclease 치료).
통계
사이의 비교는 그룹을 만들 중 하나를 사용하여 학생의 t-테스트,Wilcoxon 테스트,프리드먼 또는 Kruskal-스 테스트,one-way ANOVA,양방향 또는 반복 측정을 사용한 분산 분석 결과에 따라뿐만 아니라,개수 및 형식의 그룹입니다., 할 때 여러 비교 평가 했,적절한 포스트-hoc 보정 테스트들과 같이 사용 던,Dunnett 의,Sidak 또는 Bonferroni 습니다. 사이 연결 AwMA,AmtDNA 및 anti-HSP60 었으로 계산 Spearman 상관. Aca 결과에 따라 이들 항체의 분포를 Wilcoxon test 를 사용하여 비교 하였다. AwMA 또는 AmtDNA 와 임상 결과 사이의 연관성은 이변량 및 다변량 선형 및 로지스틱 회귀에 의해 연구되었다., 임상 결과를 공부는 평균 인딤 미디어 두께,백분율 변화의 흐름을 중재 팽창(FMD)의 상완 동맥,존재의 구제역,존재하는 플라크에서 경동맥,thrombotic 이벤트,백혈구,혈소판 계산 증가,DNA binding by Farr assay 정상 범위에 대한 테스트 실험실,손상의 존재에 따라 SLICC 손상 인덱스(SDI>0),높은 활동에 따라 SLEDAI-2K 활동 점수(SLEDAI≥4), 존재는 루푸스의 신장염,생 검 클래스,뿐만 아니라 만성적이고 활동 지수에서검입니다., 후자의 조정에 대한 질병 기간,연령,체질량지수(BMI),저밀도 지단백(LDL)콜레스테롤,항말라리아 약 및 프레드니손. 로지스틱 회귀는 홀수 비율과 95%Wald 신뢰 구간으로 표시됩니다. 참가자의 결과는 youden 의 지수를 최대화 한 후 확인 된 컷오프 값 이상일 때 AwMA 및 AmtDNA 에 대해 양성으로 간주되었습니다. 10,000 개의 부트 스트랩 샘플을 사용하여 컷오프에 대해 95%신뢰 구간을 얻었습니다. 성능 측정 값은 95%의 정확한 신뢰 구간으로 표시됩니다.,
소프트웨어
Western blot 이미지는 Image Studio Digits5.2(LI-COR biotechnology)를 사용하여 획득했습니다. 아가 로스 겔을 통한 mtDNA 이동을 Image Lab6.0.1(Bio-Rad)을 사용하여 이미지화 하였다. Dls 연구는 내장 된 Zetasizer7.10 소프트웨어(Malvern Instruments)를 사용하여 수행되었습니다. EM 이미지는 이미지 캡처 소프트웨어 601.384(ADVANCED Microscopy Technologies Corp.,WOBURN,MA,USA)로 획득되었습니다. 유동 세포 계측법은 BD FACSDiva™6.1.3(BD Biosciences)을 사용하여 수행되었습니다. DNA 분리로부터의 수율은 ND-1000 3.8 을 사용하여 정량화되었다.,1 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)및 qPCR 을 RotorGene6.1(Corbett Research/QIAgen)으로 수행 하였다. 광학 밀도는 SoftMax Pro5.4.1(분자 장치)을 사용하여 측정되었습니다. 수치는 ImageJ1.47(NATIONAL Institutes Of Health,ROCKVILLE,MA,USA)및 Photoshop CS6 13.0(Adobe Systems Inc.)으로 조립되었습니다.,마운틴 뷰,캘리포니아,미국). 통계 분석은 Prism7software(GraphPad Software Inc.)로 수행되었습니다.,La Jolla,CA,USA)및 SAS 버전 9.4(SAS Institute Inc.,캐리,노스 캐롤라이나,미국).피>