Microscoopresolutie: Concepten, factoren en berekening
rekening houdend met alle bovenstaande theorieën, is het duidelijk dat er een aantal factoren zijn waarmee rekening moet worden gehouden bij het berekenen van de theoretische grenzen van de resolutie. De resolutie is ook afhankelijk van de aard van de steekproef. Laten we eens kijken naar het berekenen van de resolutie met behulp van Abbe ‘ s diffractie limiet en ook met behulp van het Rayleigh criterium.,
ten eerste moet eraan worden herinnerd dat:
NA= n x sin α
waarbij n de brekingsindex van het beeldmedium is en α de helft van de hoekopening van het object is. De maximale hoekopening van een object is ongeveer 144º. De sinus van de helft van deze hoek is 0.95. Bij gebruik van een immersie objective met olie met een brekingsindex van 1,52, de maximale NA van het object is 1,45. Bij gebruik van een’ droge ‘ (niet-immersie) doelstelling zal de maximale NA van het doel 0,95 zijn (aangezien lucht een brekingsindex van 1,0 heeft).
Abbe ‘ s diffractieformule voor laterale (d.w.z., XY) de resolutie is:
d = λ / 2 NA
waarbij λ de golflengte van het licht is die wordt gebruikt om een monster af te beelden. Bij gebruik van een groen licht van 514 nm en een oil immersion objective met een NA van 1,45, dan is de (theoretische) grens van de resolutie 177 nm.
Abbe ‘ s diffractieformule voor axiale (d.w.z. Z) resolutie is:
d= 2 λ/NA2
nogmaals, als we uitgaan van een golflengte van 514 nm om een monster met een doel van na waarde 1,45 waar te nemen, dan zal de axiale resolutie 488 nm zijn.
Het Rayleigh-criterium is een licht verfijnde formule gebaseerd op Abbe ‘ s diffractiegrenzen:
R= 1.,Λ / NAobj+NAcond
waarbij λ de golflengte van het licht is die wordt gebruikt om een monster af te beelden. NAobj is de NA van het doel. NAcond is de NA van de condensor. Het cijfer van ‘1.22’ is een constante. Dit is afgeleid van Rayleighs werk over Bessel functies. Deze worden gebruikt voor het berekenen van problemen in systemen zoals golfvoortplanting.
rekening houdend met de NA van de condensor is lucht (met een brekingsindex van 1,0) in het algemeen het beeldmedium tussen de condensor en het objectglaasje. Aangenomen dat de condensor een hoekopening heeft van 144º dan is de Naconde waarde gelijk aan 0,95.,
bij gebruik van een groen licht van 514 nm, een olie-immersiedoelstelling met een NA van 1,45, condensor met een NA van 0,95, dan is de (theoretische) oplossingslimiet 261 nm.
zoals hierboven vermeld, hoe korter de golflengte van licht wordt gebruikt om een specimen te afbeelden, dan zal het meer detail worden opgelost. Dus, als het gebruik van de kortste zichtbare golflengte van licht van 400 nm, met een oil immersion objective met een NA van 1,45 en een condensor met een NA van 0,95, dan R zou gelijk 203 nm.,
om de maximale (theoretische) resolutie in een microscoopsysteem te bereiken, moet elk van de optische componenten de hoogste beschikbare NA hebben (rekening houdend met de hoekopening). Bovendien zal het gebruiken van een kortere golflengte van licht om het specimen te bekijken de resolutie verhogen. Ten slotte moet het hele microscoopsysteem correct worden uitgelijnd.