Anti-mitokondrie autoantistoffer i systemisk lupus erythematosus og deres tilknytning til sykdom manifestasjoner
Studere godkjenning
pasientpopulasjoner
Den menneskelige sera er testet i denne studien ble foretatt av University Health Network research ethics-brett (REB) godkjent studie av SLE og APS pasienter i Toronto, så vel som fra friske kontroller og PBC pasienter rekruttert fra CHU de Québec – Université Laval REB godkjente studier i Quebec City., SLE pasienter hadde å møte 1982 ACR-kriteriene for klassifisering for SLE revidert i 199781,82 og APS pasienter møtte 1999 Sapporo kriterier for APS revidert i 200683,84. For SLE, sammenhengende kvinnelige pasienter fra University of Toronto Lupus Klinikk (UTLC) ble kontaktet og gitt samtykke fra August 2010 og oktober 2011 å være en del av en undersøkelse om rollen til fettsyrer og hjerte-og karsykdommer i lupus. De ga en blodprøve og fikk sitt anonymisert kliniske data som er knyttet til deres biospecimen., På samme måte, APS pasienter sett på rheumatology klinikk i Toronto ble kontaktet etter en lignende prosedyre. Alle gjenværende biospecimen kan brukes for fremtidige studier på biomarkører for lupus som per den opprinnelige fag’ samtykke. Sunn kontroll frivillige ble rekruttert som en del av studiet på markører for betennelse hvis de hadde ingen kjente sykdommer og ikke ha smittsomme symptomer på tidspunktet for blodprøvetaking. Alder og kjønn var samlet på den tiden. PBC pasienter møtte 2009 PBC kriteriene for klassifisering, revidert i 201838,85 inkludert positivitet for anti-mitokondrie antistoff.,
Data fra kliniske laboratorier
For SLE-pasienter, anti-dsDNA ble målt ved hjelp av Farr analyse (i laboratoriet cut-off på 30%) og anti-cardiolipin (IgG og IgM – laboratorium cut-offs 40 GPL eller MPL-enheter) ble målt ved ELISA i en klinisk laboratorium.
Celle kultur
Inducible mus modell av SLE
Anbefalinger av Canadian Council on Animal Care ble fulgt i en protokoll som er godkjent av Animal Welfare Committee ved Université Laval., C57BL/6 J ble innhentet fra Jackson Laboratories (i Bar Harbor, ME, USA) og ligger i en Elite-Pluss bestemt-patogen-gratis animal anlegget på CHU de Quebec. SLE autoantistoffer ble indusert i disse musene som tidligere described63. I korte trekk, er 6-8 uker gamle hann mus mottatt 100 µL jeg.v. injeksjoner av ß2GPI (20 µg) (Crystal Kem, Downers Grove, IL, USA) etterfulgt 24 timer senere av en 100 µL jeg.v. injeksjon av lipopolysaccharide (LPS fra E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Disse injeksjonene ble gjentatt etter 2 og 4 uker for en sum av tre runder av vaksinasjoner og mus ble bled 48 t etter tredje immunisering. C57BL/6 J mus injisert jeg.v. med PBS under samme tidsplan ble brukt som kontroller.
Etikk
Gjennom hele studiet, blodprøver ble innhentet fra pasienter under informert samtykke. Alle metodene som presenteres i denne studien var utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter for både menneskelige og murin givere.,
Mitokondrier isolasjon
Mitokondriene ble isolert fra livers av C57BL/6 J mus etter en kombinasjon av publiserte protocols61,62. Mus ble ofret av livmorhalskreft forvridning, leveren ble raskt fjernet, galleblæren excised, og leveren ble skylt i iskald PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Leveren ble deretter kvernet og overført til en pre-avkjølt glass/Teflon vev grinder som inneholder 12 mL iskaldt mitokondrie isolasjon buffer (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM sukrose) per gram av leveren, så jord til en homogen suspensjon ble innhentet. Intakte celler og kjerner ble pelletert to ganger på 700 g, 4 °C, 10 min. Forurensende membraner, proteiner og organeller ble eliminert av to sentrifugering på 7000 g, 4 °C, 10 min etterfulgt av sentrifugering på 10 000 g, 4 °C, 10 min., Den rå mitokondrie suspensjon ble videre renset ved ultracentrifugation mot en Percoll gradient (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v:v Percoll) på 95,000 g, 4 °C, 30 min. Bandet inneholder mitokondrier ble samlet inn i PBS. En lignende tilnærming ble brukt til å isolere menneskelige mitokondrier med unntak av at opp til 107 Hep-G2 celler ble lysert med gjentatt passeringer gjennom en smal-gauge nål., Den kommersielle kit QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Tyskland) ble også brukt, i henhold til produsentens instruksjoner, å isolere mitokondrier fra Hep-G2 celler for kvalitet sammenligning av western blotting med den nevnte protokoll. Isolerte mitokondrier ble dosert ved bicinchoninic syre (BCA) – metoden ved hjelp av BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA). Fersk isolerte mitokondrier ble brukt i alle eksperimenter med unntak av submitochondrial partikler preparater som pelletert mitokondriene ble holdt ved -80 °C til nødvendig.,
Submitochondrial partikler (SMP) utarbeidelse
SMP var forberedt som beskrevet elsewhere60. Kort, frosne mitokondriene ble tint ved romtemperatur og fortynnet til 10 mg av mitokondrie proteiner i 10 mM 4-Morpholinepropanesulfonic syre (MOPPER). Prøvene ble deretter sonicated ved hjelp av en Fisher Sonic Dismembrator Modell 500 (Thermo Scientific) på 20% maksimal utgang for 20 sekunder og deretter holdt på en salt-is vannbad i 10 minutter. Denne syklusen ble gjentatt ni ganger., Prøvene ble deretter sentrifugerte på 16 000 g, 4 °C, 10 minutter for å forkaste ubrutt mitokondrier og andre uønskede rester. Supernatants ble samlet i et nytt rør og deres volum justeres til 2 mL i 10 mM MOPPER. Prøvene ble deretter ultracentrifuged på 150,000 g, 4 °C i 45 minutter. Pelletert SMP ble resuspendert i SMP-buffer (225 mM mannitol, 75 mM sukrose, 10 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7.4) og doseres. SMP forberedelser ble holdt ved -80 °C til nødvendig.,
Røde blodlegemer mikropartikler (RBCMP) utarbeidelse
Røde blodceller (RBC) ble isolert fra blodet av sunn menneskelig frivillige ved sentrifugering på 282 g i 10 minutter ved RT. Blodplater rike plasma og buffy coat ble forkastet, og RBC brøkdel holdt. RBC ble regnet (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) og justert til en konsentrasjon på 5 × 108 celler/mL i Tyrode er buffer (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukose, 10 mM HEPES, pH 7.4)., 109 celler ble så fortynnet i 45 mL dobbel-destillert vann og inkubert i 5 minutter. Den tonicity av bufferen var så balansert med tillegg av 5 ml PBS-10X (filtrert gjennom et 0.22-mikrometer membran). Rest RBC ble fjernet ved sentrifugering på ca 1300 g i 5 minutter ved RT og supernatanten ble centrifugated på 18000 g for 90 minutter på 18 °C. RBC microparticle pellet ble deretter suspendert i 500 µl PBS. Protein konsentrasjon ble målt med BCA analysen.,
Western blotting
Mitokondrie størrelse måling av dynamisk lys spredning (DLS)
størrelsen på den isolerte mitokondrier ble målt ved DLS, ved hjelp av en Zetasizer Nano ZS enhet (Malvern instruments, Malvern, UK) utstyrt med standard 4 mW, 633 nm He-Ne laser som en lyskilde, satt på en oppdagelse vinkel 173°. Eksperimenter ble gjentatt tre ganger i 1 cm lengde disponibel UV-Kyvettene (Helt GMBH, Wertheim, Tyskland) som inneholder 100 µL av isolert murin mitokondrier fortynnet i PBS i en konsentrasjon på 10 µg proteiner/µL., Følgende parametere ble tatt i betraktning ved måling av størrelsen på mitokondrie: brytning indeks av løsemiddel: 1.330, viskositet eksempel: 0.8872 mPas, brytning indeks av proteiner: 1.45, temperatur: 25 °C.
Elektron mikroskopi
Mitokondrier (108) ble fikset i 3.5% acrolein for 15 min i romtemperatur. Fast prøvene ble skylles to ganger i PBS så innebygd i 4% agarose. 50 µm deler ble kuttet ved hjelp av en vibratome, post-fast-i-1% osmium tetroxide for 30 minutter, og innebygd i Durcupan harpiks., Sytti-nanometer ultrathin seksjoner ble visualisert på 80 kV ved hjelp av en Tecnai G2 Ånd BioTWIN (FEI, Hillsboro, ELLER, USA) transmission electron microscope.
Vurdering av mitokondrie oksygenforbruk
Mitokondriene ble resuspendert i mitokondrie-analyse løsning (MAS: 70 mM sukrose, 220 mM mannitol, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA og 0,2%(w/v) fettsyre-gratis BSA, pH 7.4 ved 37 °C) og supplert med 10 mM pyruvate, 2 mM malate og 4 µM FCCP , pH 7.4. En tilsvarende 10 µg proteiner var seedet på XF-96 plater (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Platene ble så sentrifugerte 2,000 g i 20 min ved 4 °C. Vi visualisert fordelingen av mitokondrier under en lys-feltet mikroskop for å sikre etterlevelse og homogen repartisjonere. Platene ble opprettholdt ved 37 °C uten CO2 for ca 40 minutter før lasting. Oksygenforbruk priser (OCR) ble målt i samsvar med produsentens anvisninger (Agilent/Sjøhest Bioscience). Eksperimenter ble kopiert i tre brønner og gjennomsnitt for hver eksperimentelle tilstand., Av en total av 3 målinger av oksygen forbruk for hver tilstand ble gjort ca hver 6 minutter under basal betingelser og etter sekvensiell tillegg av rotenone (2 µM), succinate (10 mM), antimycin En (40 µM) og TMPD (N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine)/Ascorbate (100 µM/10 mM). Succinate ble brukt som electron donor for kompleks II, rotenone som et komplekst jeg inhibitor, antimycin En som en kompleks III-hemmer og åndedrett gjennom komplekse IV ble målt ved hjelp TMPD/ascorbate.,
Høy følsomhet flowcytometri
på Grunn av sin lille størrelse, mitokondriene ble oppdaget av høy følsomhet flowcytometri, ved hjelp av en «liten partikkel alternativet» som består av en forward scatter (FSC) koplet til en photomultiplier rør (PMT) som er montert på en BD FACS Canto II Spesielle For Forskning Produkt (SORP, BD Biovitenskap). Mitokondriene (0.5 µg) ble farget med 1 µg av anti-TOMM22-Atto 488 (klone IC9-2, Sigma-Aldrich) og 1 µM av mitotracker dyp rød (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 30 minutter ved 37 °C og fortynnet med PBS til et endelig volum på 500 µl før flowcytometri analyse., For å kvantitativt måle antall mitokondrier, vi brukte 3 µm diameter polystyren mikrosfære (Polysciences, PA, USA). 80,000 mikrosfærer ble lagt til hver prøve og 500 mikrosfærer ble kjøpt. Silica partikler (Kisker Biotech, Steinfurt, Tyskland) ble brukt til å bestemme 100-1,000 nm størrelse.
Mitokondrie DNA-ekstraksjon ved alkalisk lyse
Isolerte mitokondrier ble pelletert på 10 000 g, 4 °C, 10 min og resuspendert i 0,8 mL mtDNA isolasjon buffer-En for hver 3 mg av mitokondrie proteiner., Mitokondriene ble deretter lyzed i ett volum (v): v) mtDNA isolasjon buffer B (extemporaneously forberedt. 0,2 M NaOH, 1% SDS) etter 3 min. på isen, under forsiktig omrøring. mtDNA suspensjoner ble nøytralisert med ett volum (v): v) mtDNA isolasjon buffer C (1.32 M kalium acetat, pH 4.8 justert med iskald eddiksyre) i 5 min. på isen, under forsiktig omrøring. Mitokondrie rusk ble pelletert ved sentrifugering i 10 minutter ved 14,000 g, RT. Supernatants ble overført til nytt rør. mtDNA ble kastet over natten ved -20 °C med 0.,1-volum (v): v) kalium acetat (lager løsning: 3 M natrium acetat, pH justert til 5.2 med iskald eddiksyre) og 0,7 volum (v): v) absolutt isopropanol. mtDNA ble deretter pelletert i 14 000 g, skylt tre ganger med 1,5 mL 70% etanol og resuspendert i DNA resuspensjonsbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). Mitokondrie DNA-konsentrasjon ble bestemt ved spektrofotometri (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
Kjerner isolasjon fra mus hepatocytter
Kjerner ble isolert fra mus livers ved hjelp av publisert methods86., Kort, under mitokondrier isolasjon protokoller, mens supernatants ble brukt for å utføre mitokondrier isolations, pellets fra den første 700 g sentrifugering ble resuspendert i 10 mL iskald kjerner isolasjon buffer-En (5 mM MgCl2, 10 mM Tris–HCl, 250 mM Sukrose. pH 7.4) og bakken i en pre-avkjølt glass/Teflon vev grinder. Suspensjonen ble ytterligere forstyrret av tre passeringer gjennom en 25 G5/8-gauge nål etterfulgt av to passeringer gjennom en 27 G ½ gauge nål., Suspensjonen ble så filtrert mot en 40 µM nylon celle sil (Thermo Fisher Scientific) og sentrifugerte på 600 g, 4 °C, 10 min. Pellets ble resuspendert i 14 mL buffer-En og sentrifugerte på 600 g, 4 °C, 10 min. Pellets da ble resuspendert i 9 bind av is-kaldt kjerner isolasjon buffer B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris– HCl, 2.0 M sukrose. pH 7.4) og sentrifugerte på 16 000 g, 4 °C, 30 min. Pellets ble resuspendert i 200 µL PBS og lagret ved -20 °C.,
Hele cellen og kjernefysiske DNA isolert
DNA fra enten 25 mg av hele mus lever-eller 200 µL eller isolert kjerner ble trukket ut ved hjelp av QIAmp® DNA Mini Kit (QIAgen), og følge instruksjonene fra produsenten. Prøvene ble eluted i DNA resuspensjonsbuffer.,
Mitokondrie-DNA og kjernefysiske DNA enrichments av qPCR
Tretti nanogram av mitokondrie-DNA, kjernefysiske DNA eller samme mengde totalt DNA ekstrahert fra hele mus leveren ved hjelp av de nevnte protokoller, ble forsterket i en Rotor-Gene Q real-time qPCR cycler (QIAgen) i henhold til standard protokoller med SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) i en 10 µL reaksjon volum., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
Mitokondrie-DNA fordøyelsen av begrensning enzymer
Renset musen mtDNA ble fordøyd av Hae II eller Pst-jeg begrensning endonucleases (NEB, Os, ON, Canada) i henhold til produsentens protokollen. Fordøyd produkter (1.5 µg) så ble løst på en 0,5% (w/v) agarose-gel. Bildene ble kjøpt på en Chemidoc MP gel dokumentasjonssystem (Bio-Rad). Full-lengde gel er presentert i Supplerende Fig. 6d.,
S1 nuclease behandling av mitokondrie-DNA og kjernefysiske DNA
30 µg mtDNA og nDNA ble fortynnet i 200 µL 1X S1-buffer og behandlet med 50 U S1 nuclease (Thermo Fischer Scientific) i 5 minutter ved 37 °C. Reaksjon ble stoppet av tillegg på 600 mM EDTA (endelig konsentrasjon) og inkubering ved 70 °C i 10 minutter. Prøvene ble påskyndet av tillegg på 300 mM Natrium Acetat (endelig konsentrasjon) og 2 volumer (v:v) absolutt etanol i 16 timer ved -20 °C., Prøvene ble pelletert i 14 000 g, RT, 20 minutter, og vasket 1 mL 70% etanol og resuspendert i DNA resuspensjonsbuffer. For konkurranse analyser, ubehandlet nDNA og mtDNA fulgt samme behandling uten tillegg av enzymet. Prøvene ble dosert ved qPCR.
Mitokondrier oksidasjon in-vitro
Dosert mitokondriene ble pelletert og resuspendert i en konsentrasjon på 1,5 mg mitokondrie proteiner/mL PBS som inneholder 500 µM av oxidant tertbutyl hydroperoxide (TBHP) (Sigma-Aldrich)., Mitokondriene oksidert for 1 t 30 min ved 37 °C under forsiktig omrøring deretter skylles to ganger med iskald PBS. Oksidert mitokondrier senere ble kvantifisert ved BCA.
Mitokondrie lipid oksidasjon
Thiobarbituric syre reaktive stoffer (TBARS) dannelse ble vurdert, ved hjelp av TBARS Parameter Kit (R&D systemer, Minneapolis, MINNESOTA, USA), i henhold til produsentens instruksjoner. To hundre mikrogram av mitokondrier var lysert, proteiner, ble utløst ved hjelp av trekloredikksyre (TCA) og pelletert på rundt 12 000 g, romtemperatur, 4 min., Den supernatants ble overført til nytt rør. Prøver (75 µL) ble inkubert med 37.5 µL av thiobarbituric syre i en 96-brønns plate for 3 h ved 50 °C. Absorbances ble lest på 532 nm på en SpectraMax 190 mikroplate leser (Molekylære Enheter, Sunnyvale, CA, USA) og TBARS var kvantifisering utføres ved hjelp av standard kurve som følger med i settet. Oksidert prøvene ble sammenlignet med kontroll mitokondrier som ble inkubert under de samme forholdene i PBS blottet for TBHP.,
Mitokondrie protein oksidasjon
dannelsen av karbonyl moieties følgende in-vitro mitokondrie oksidasjon ble målt ved hjelp av Protein Karbonyl Innhold Assay Kit (Sigma-Aldrich) følge instruksjonene fra produsenten. Oksidert prøvene ble sammenlignet med kontroll mitokondrier som ble inkubert under de samme forholdene i PBS blottet for TBHP.,
Påvisning av antistoffer målretting mitokondrie epitopes av ELISA
For påvisning av anti-hele mitokondrie antistoff (AwMA), murin mitokondriene ble fortynnet (500 µg/mL) i 50 mM karbonat/bikarbonat buffer, pH 9.6 og 25 µL pr. brønn ble lastet på 96-vel halvparten-området klart flat bunn polystyren med høy bindende microplates (Corning, New York, USA). Platene var belagt for 18 timer ved 4 °C og deretter sperret for 4 h ved 37 °C med PBS som inneholder 10% FBS og 0,5% gelatin. Etter tre vask med PBS, sera fortynnet 1:150 (med mindre annet er angitt) i PBS-10% FBS-0.,3% gelatin ble inkubert over natten ved 4 °C i duplikat. Etter tre vask med PBS, plater ble inkubert for 1 h i romtemperatur med alkalisk fosfatase-(AP) conjugated geit anti-mus eller anti-human IgG (Sigma-Aldrich) utvannet 1:1000 i PBS-0.4% bovint serum albumin (BSA). Platene ble skylt tre ganger med PBS og utviklet med p-nitrophenol fosfat (p-NPP) for ~30 min ved 37 °C og optisk tetthet (OD) ble lest ved 405 nm på en mikroplate leser., Den samme protokollen som ble brukt for påvisning av autoantistoffer målretting submitochondrial partikler ved hjelp av 25 µL pr. brønn av SMP utvannet (50 µg/mL) i 50 mM karbonat/bikarbonat buffer, pH 9.6. En lignende tilnærming ble brukt for menneskelig mitokondrier med følgende endring: plater ble inkubert med pepperrot peroksidase-conjugated anti-human IgG sekundært antistoff (1:3,000), peroksidase aktivitet ble avslørt ved romtemperatur i ~5 min med 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB). Reaksjonen ble stoppet med 2 N H2SO4 og ODs-filer på 450 nm., For anti-mtDNA ELISA, plater ble pre-belagt med 1% protamine sulfat i dobbel-destillert vann i 1 time ved romtemperatur. Platene ble skylt tre ganger med PBS og belagt over natten ved 4 °C med 400 ng mt-dna i PBS. Alle etterfølgende trinn var identiske med dem som brukes for AwMA-ELISAs. Tomme verdier (mitokondrie-antigener og ingen sera) var substracted fra målte verdier for hver pasient. Under utviklingen av disse analysene, riktig belegg av brønnene ble testet ved hjelp av isotype-matchet musen monoklonale antistoffer (mAb). Et monoklonalt antistoff (Klone IV.,3, 4 µg/mL) ble brukt som en negativ analyse kontroll i hvert enkelt tilfelle, mens ulike monoklonale antistoffer ble brukt, avhengig av belegg antigener, som positive analysen kontroller: en anti-TOMM22 mAb (Klone IC9-2, 4 µg/mL. Abcam) for intakt mitokondriene, en anti-DNA-mAb (Klone 35I9 DNA, 10 µg/mL. Abcam) eller en anti-Cytokrom C mAb (Klone 7H8.2C12, 5 µg/mL. BD Biovitenskap).,
Konkurranse analysen
AwMA-ELISAs ble utført som beskrevet i forrige avsnitt med følgende endringer: serumprøver ble pre-inkubert i fortynning buffer (1:150) tilsatt ulike konsentrasjoner (0.25, 1 og 3 mg/mL) av konkurrenter (dvs. mitokondrier eller røde blodlegemer mikropartikler) for 3 timer. på RT og inkubert i duplikat over natten ved 4 °C. Data er presentert som andel av signal igjen etter hver konkurranse, i forhold til OD (405 nm) målt i fravær av konkurrenter.,
En lignende prosedyre ble brukt for AmtDNA-ELISA, ved hjelp av økte konsentrasjoner (0, 3, 9 og 27 ng/µL) av konkurrerende DNA (hentet fra kjerner eller mitokondrier, med eller uten S1 nuclease behandling).
Statistikk
Sammenligninger mellom grupper ble gjort ved hjelp av enten en Student ‘ s t-test, Wilcoxon-test, Friedman eller Kruskal-Wallis-tester, en-veis ANOVA, to-veis eller gjentatt tiltak ANOVA, avhengig av utfallet, så vel som antall og type grupper., Når flere sammenligninger ble vurdert, passende post-hoc korreksjon tester ble brukt som Dunn ‘s, Dunnett’ s, Sidak eller Bonferroni-tallet. Assosiasjoner mellom AwMA, AmtDNA og anti-HSP60 ble beregnet med Spearman sammenhenger. Fordelingen av disse antistoffene i henhold til ACA-resultatene ble sammenlignet ved hjelp av Wilcoxon-testen. Assosiasjoner mellom AwMA eller AmtDNA og kliniske resultatene ble studert av bivariate og multivariate lineære og logistiske regresjoner., Kliniske utfall studert er gjennomsnittlig intima-media tykkelse, prosent endring av flow-mediert dilatasjon (FMD) av brachialis arterien, tilstedeværelse av FMD, tilstedeværelse av plakk i carotis, trombotiske event noensinne, hvit telle blodceller, blodplater, økt DNA-binding ved Farr analysen over normalområdet for testing laboratory, tilstedeværelse av skade i henhold til SLICC Skade Indeks (SDI > 0), høy aktivitet i henhold til SLEDAI-2K activity score (SLEDAI ≥ 4), tilstedeværelse av lupus nefritt, biopsi klasse, samt chronicity og aktivitet indeks fra biopsi., Sistnevnte ble justert for sykdom varighet, alder, body mass index (BMI), low-density lipoproteiner (LDL) kolesterol, antimalariamidler medisiner og prednisone. Logistiske regresjoner er presentert med odd-forhold, og deres 95% Wald konfidensintervall. Deltakernes resultater ble vurdert som positivt for AwMA og AmtDNA når deres verdi var over cut-off-verdi identifisert etter å maksimere Youden-Indeksen. Et 95% konfidensintervall ble innhentet for cut-off med 10,000 bootstrap prøver. Ytelse tiltak er presentert med sine 95% nøyaktig konfidensintervall.,
– Programvare
Western blot bilder ble anskaffet ved hjelp av Image Studio Sifre 5.2 (LI-COR bioteknologi). mtDNA migrasjon gjennom agarosegel var avbildes ved hjelp av Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). DLS studier ble gjennomført ved hjelp av det innebygde Zetasizer 7.10 programvare (Malvern Instruments). EM bilder ble ervervet med Bilde Fange Programvare 601.384 (Avansert Mikroskopi Teknikker Corp., Woburn, MA, USA). Flowcytometri ble utført ved hjelp av BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biovitenskap). Avkastning fra DNA isolations ble kvantifisert ved bruk av ND-1000 3.8.,1 programvare (Thermo Fisher Scientific) og qPCR ble utført med RotorGene 6.1 (Corbett Forskning/QIAgen). Optisk tetthet ble målt ved hjelp av SoftMax Pro 5.4.1 (Molekylære Enheter). Tallene ble satt sammen med ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) og Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc. Mountain View, CA, USA). Statistiske analyser ble utført med Prisme 7-programvaren (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) og SAS versjon 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).