PMC (Norsk)
Diskusjon
Det er viktig å forholde seg gen varianter kliniske phenotypes ved hjelp av riktig phenotyping verktøy av CYP3A4 aktivitet. Det 3-hydroksylering av quinine hadde vist seg som en biomarkør reaksjon for CYP3A4 aktivitet fordi 3-hydroksylering av quinine er catalyzed av CYP3A4 både in vivo og in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Derfor, den kinetiske parametere av enzymatisk katalyse på quinine 3-hydroksylering ble brukt som et mål på CYP3A4 aktivitet i den foreliggende studien.
Tjue-tre av rekombinant CYP3A4 holoenzymes viste signifikant redusert CLint mot quinine. Seks varianter, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift), og CYP3A4*21 (Y319C), utstilt mye lavere CLint for quinine (1.44–5,80 ph-verdi%, Tabell 2) enn vill-type CYP3A4*1A., Hvis våre funn i in vitro-er replikert i kliniske studier, pasienter som er bærere av disse allelene kan være potensielt CYP3A4 dårlig metabolizers og kan: i) krever lavere quinine doser for å nå terapeutisk plasmakonsentrasjon; og ii) være økt risiko for bivirkninger og toksisitet når konvensjonelle doser av kinin, brukes.
CYP3A4*2 (S222P) viste en redusert CLint av mer enn sixfold (14.76%, Tabell 2) for quinine sammenlignet med vill-type CYP3A4*1A., Dette reduserte enzymatisk aktivitet kan være fordi en serin→proline-amino-acid substitusjon kan føre til en stor endring i den tredimensjonale struktur av enzymet (proline er kjent for å bryte alfa-helices). Likeledes, CYP3A4*2 har blitt rapportert til å ha en lavere CLint for midazolam (Miyazaki et al., 2008), nifedipin (Sata et al. I 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018), og lidokain (Fang et al., 2017), enn vill-type enzym. I kontrast, CYP3A4*2 viste en høyere CLint for amiodarone (Yang et al., 2019)., For testosteron, CYP3A4*2 hadde en redusert iboende klaring når det uttrykkes ved hjelp av Escherichia coli express-systemet in vitro (Miyazaki et al., 2008), men aktiviteten var sammenlignbar med wild-type enzym når det uttrykkes i baculovirus uttrykk systemet (Sata et al., 2000) (Tabell 3).
CYP3A4*3 (M445T) vises lavere enzymatisk aktivitet mot quinine, sammenlignet med vill-type allelet (Tabell 2)., Den amino-syre rester 445 ligger innenfor bevart heme-bindende region, bare to amino-syre C-terminaler til absolutt bevart Cys i posisjon 442 i CYP3A4 protein (Sata et al., 2000), og det er derfor en Met445Thr endring kan utøve en ugunstig effekt på heme bindende, noe som resulterer i en endring i katalytisk aktivitet av enzymet, spesielt når bindende et egnet substrat. Men som angitt i Tabell 3, enzymatisk aktivitet av CYP3A4*3 var lik som vill-type CYP3A4 for de fleste underlag testet., Spredningen av resultatene som kan oppstå fra ulike heterologous uttrykk metodene som er brukt, og på grunn av ulik substrat spesifisitet for variant.
CYP3A4*4 (I118V) viste lavere CLint mot quinine, i forhold til wild-type CYP3A4*1A. Studier av nettstedet-anvist mutagenesis tyder på at ser119 er en viktig aminosyre innblandet som en aktiv stedet rester (Yano et al., 2004). Derfor, Ile118Val mutasjon er egnet til å påvirke konformasjon av det aktive området, noe som resulterer i redusert katalytisk aktivitet., På samme måte, en in vivo studie viste at forholdet mellom urin nivå av 6β-hydroxycortisol/gratis kortisol i disse heterozygote individer var lavere enn hos friske kontroller, noe som tyder på redusert enzymatisk aktiviteter (Hsieh et al., 2001).
Begge CYP3A4*8 og *13 varianter vises synlig, om enn lavere nivåer av CYP3A4 holoproteins og hadde ekstremt lave katalytisk aktiviteter mot quinine. I motsetning til våre resultater, CYP3A4*8 og *13 har blitt rapportert å ha ingen påvisbare CYP holoproteins når det uttrykkes i bakterielle systemer (Eiselt et al., 2001)., Vi spekulerer i at bruken av bakterielle vs. insekt uttrykk systemer kan forklare de ulike resultatene. Den bakterielle uttrykk systemet mangler en intracellulære membran miljø (Gonzalez og Korzekwa, 1995) som kreves for høyt uttrykk av protein. I kontrast, insekt-celler kan behandle og endre proteiner på en lignende måte som menneskelige celler, slik at riktig folding av enzymet og inkorporering av heme kofaktor, noe som resulterer i høyere uttrykk av CYP3A4 proteiner.,
CYP3A4*11 (T363M) ble uttrykt betydelig lavere nivåer enn vill-type CYP3A4 (Figur 2), et funn som er i tråd med studier ved hjelp av bakterielle eller nukleære uttrykk systemer (Eiselt et al. I 2001; Murayama et al., 2002). Threonine på rester 363 innen underlaget anerkjennelse nettstedet (SRS)-5 kan bidra til hydrogenbinding nettverk dannelse. En substitusjon fra threonine til metionin kan resultere i tap av katalytisk aktivitet (Murayama et al., 2002). Så CYP3A4*11 vises redusert quinine hydroksylering aktivitet i denne studien., I tillegg, CYP3A4*11 viste redusert testosteron hydroksylering aktivitet (Murayama et al., 2002), hadde bemerkelsesverdig økt CLint mot lidokain (Fang et al., 2017) og amiodarone (Yang et al., 2019), men var ikke assosiert med merkbare endringer i metabolske aktiviteter for ibrutinib (Xu et al., 2018) (Tabell 3).
CYP3A4*12 (L373F) viste en dramatisk redusert CLint mot quinine, i likhet med tidligere forskning resultat mot midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4*12 besitter en amino-syre endring av Leu373Phe; det muterte rester ligger i nærheten av Arg-372 og Glu-374, som deltar i dannelsen av en hydrogen-binding nettverk og er involvert i aktive nettsteder i henhold til studier som involverer stedet-anvist mutagenesis (Yano et al., 2004). Derfor, mutational rester (L373F) er egnet til å påvirke stabilitet, hydrogen-binding nettverk og romlig konformasjon av aktiv-området hulrom, noe som resulterer i endret katalytisk aktivitet av CYP3A4*12.,
CYP3A4*20 (488 frameshift) viste bemerkelsesverdig redusert apoprotein uttrykk (Figur 1) og dramatisk redusert CLint mot quinine. I kontrast, ingen katalytisk aktiviteter av midazolam 1′- og 4-hydroksylering har blitt rapportert i gjær eller HEK 293 mikrosomer å uttrykke CYP3A4*20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Disse motstridende resultatene kan være knyttet til ulike heterologous uttrykk systemer og underlag som brukes i forsøkene. I tillegg, en CYP3A4*20 heterozygot, identifisert i Brasiliansk enkeltpersoner, har blitt rapportert å ha redusert systemisk clearance av ∼1.,9-fold for midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Det var tidligere har en hypotese om at denne sjeldne mutasjoner kan påvirke protein folding, heme inkorporering (Westlind-Johnsson et al., 2006), og den romlige konformasjon av aktiv-området hulrom, noe som gir opphav til en reduksjon eller tap av katalytisk aktivitet forbundet med underlaget som brukes.
CYP3A4*21 (Y319C), som ble identifisert i Kinesiske befolkningen (Zhou et al., 2011), som vises svake katalytisk aktivitet mot quinine i vår studie. Det er interessant at ingen påvisbare apoenzyme uttrykk ble identifisert i våre resultater., Tyr319 er en svært bevart rester i cytokrom P450 familie i hele eukaryote utviklingen fra nematode til menneske (Zhou et al., 2011). I henhold til in silico funksjonelle spådommer (Zhou et al., 2011), Tyr319 rester ligger på en viktig domene og en substitusjon av Tyr med Cys i posisjon 319 av CYP3A4*21 protein kan føre til dramatiske endringer i aktiv-området hulrom konfigurasjon. Derfor CYP3A4*21 kan produsere en malfunctional protein med redusert katalytisk aktivitet mot quinine., I tillegg har vi spekulert i at disse antistoffene vi brukt til å oppdage CYP3A4 rekombinant apoproteins kan ikke være egnet til å oppdage variant CYP3A4*21. Det er, mutasjon av Tyr319Cys i CYP3A4*21 kan forhindre at disse antistoffene gjenkjenner spesifikke epitopes i CYP3A4.
I motsetning til to av rekombinant CYP3A4 holoenzymes, CYP3A4*15 (R162Q) og CYP3A4*29 (F113I), viste signifikant økt CLint for quinine. På samme måte, både CYP3A4*15 og CYP3A4*29 utstilt økt CLint mot lidokain (Fang et al., 2017), men viste redusert CLint for ibrutinib (Xu et al., 2018)., CYP3A4*15 ble oppdaget først i forskjellige etniske grupperinger med små prøver for hver etnisk gruppe (Lamba et al., 2002). CYP3A4*29 var identifisert og navngitt i vår siste undersøkelse (Hu et al., 2017). De to variantene er i slekt å rask metabolisme av quinine in vitro. Dersom bekreftelse av økt quinine clearance er funnet i individer som er homozygote eller heterozygote bærere av CYP3A4*29 eller CYP3A4*15, disse personene kan være CYP3A4 ultra-rask metabolizers av kinin., Pasienter med disse genotypes mai: jeg) har dårligere terapeutisk effekt når vanlige kliniske doser av quinine administreres; og ii) krever høyere doser for å nå terapeutiske plasmakonsentrasjoner.
Ingen aktiv holoenzymes av CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop), og CYP3A4*30 (R130Stop) varianter ble oppdaget, og, følgelig, de viser ingen metabolsk aktivitet ved quinine (Tabell 2).,
CYP3A4*6 har en innsetting av en adenine rester i ekson 9 (830-831 men); denne mutasjonen fører til en frameshift og fører til oversettelse av en avkortet protein som ikke kan innlemme heme (Hsieh et al., 2001). Følgelig, katalytisk aktivitet av CYP3A4*6 mot quinine ble ikke identifisert i vår studie. Som vist tidligere i vivo, en Kinesisk person ble funnet å være heterozygot for CYP3A4*6 med en mye lavere ratio i urin nivå av 6β-hydroxycortisol:gratis kortisol enn vill-type individer, noe som tyder på redusert CYP3A4 aktivitet (Hsieh et al., 2001)., På samme måte vil en pasient som er heterozygote for CYP3A4*6, gjennomgår organtransplantasjon, hadde en takrolimus konsentrasjon-til-justert dose forholdet 4.3 ganger høyere enn vill-type pasienter (Jun et al., 2009).
CYP3A4*26 har en C→T nukleotid substitusjon i ekson 5. Dette fører til en endring fra arginin en brå stopp codon i posisjon 268, og resulterer i et antatte forkortet protein mangler katalytisk domene, og derfor aktivitet (Werk et al., 2014)., CYP3A4*26 kan ikke uttrykkes på grunn av den prematur stopp codon i posisjon 268 eller hvis det er det, protein kan være merket for rask nedbrytning (Werk et al., 2014). Derfor var vi ikke i stand til å oppdage holoprotein av CYP3A4*26 variant uttrykt i Sf21 celler. Likeledes, en 19-år gamle nyre-transplanterte pasienten, identifisert som en homozygot for CYP3A4*26 og samtidig også en homozygot for CYP3A5*3, viste en uventet høy plasmakonsentrasjon av takrolimus som et resultat av ekstremt redusert takrolimus klaring (Werk et al., 2014).,
Lik CYP3A4*26, CYP3A4*30 har en endring fra arginin en brå stopp codon i posisjon 130 (Hu et al., 2017). Den Arg130 er ansett som viktig for heme inkorporering (Eiselt et al., 2001), og dermed mutasjon av Arg130 ville forstyrre heme ble stiftet, og slik påvirke holoenzyme uttrykk av CYP3A4.
I kombinasjon med tidligere undersøkelser (Tabell 3), noen CYP3A4 alleliske varianter viste ulike preferanser for substrater i motsetning til de av vill type enzymer. Nemlig, noen varianter utstilling endret katalytisk aktiviteter med et substrat-avhengige profil., Som diskutert ovenfor, motstridende resultater som kommer fra en bestemt substrat i studier kan oppstå av mange faktorer, som for eksempel avvik fra in vitro eller in vivo metode og ulike heterologous uttrykk systemer.
Quinine har hyppige ugunstig virkninger, på grunn av sin smal terapeutisk indeks (Bateman og Dyson, 1986). Disse negative reaksjoner var ikke bare forårsaket av rusmidler, de var også forårsaket av felles quinine-holdige drikker., Basert på en systematisk gjennomgang av kliniske data fra ett hundre og fjorten artikler, bivirkninger, som ble ført fra quinine-holdige drikker, sto for 20% av den totale bivirkninger quinine (Liles et al., 2016). Overraskende, selv med liten eksponering fra vanlige drikker, noen individer har opplevd alvorlige bivirkninger som involverer flere organsystemer. Gitt åpenbare inter-individuelle mangfoldet i quinine følsomhet, variasjon i CYP3A4 kan være en mulig mekanisme underliggende quinine sensitive og ugunstig virkninger., I tillegg, forskrifter for quinine bruk har ikke vært etablert i noen land, for eksempel, piller som inneholder 50 mg eller mindre quinine er ansett som en naturlig helse produktet og er tilgjengelig uten resept Canada (Liles et al., 2016); quinine-inneholder kremer og sjampoer, samt quinine-holdige drikker, være lett tilgjengelige og tilsyn er ikke nødvendig. Dermed, økt bevissthet om inter-individuelle forskjeller i quinine følsomhet og bivirkninger quinine blant leger og offentlige antas å være nødvendig.