PMC (Polski)
dyskusja
ważne jest powiązanie różnic genów z fenotypami klinicznymi przy użyciu odpowiednich narzędzi fenotypowych aktywności CYP3A4. 3-hydroksylacja chininy została udowodniona jako reakcja biomarkera aktywności CYP3A4, ponieważ 3-hydroksylacja chininy jest katalizowana przez CYP3A4 zarówno In vivo, jak i in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Dlatego parametry kinetyczne katalizy enzymatycznej na 3-hydroksylacji chininy zostały wykorzystane jako miara aktywności CYP3A4 w niniejszym badaniu.
dwadzieścia trzy rekombinowane holoenzymy CYP3A4 wykazały znamienny spadek CLint w kierunku chininy. Sześć wariantów, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift) i CYP3A4*21 (Y319C), wykazywało znacznie niższy CLint dla chininy (1,44–5,80%, Tabela 2) niż dla dzikiego typu CYP3A4*1A., Jeśli wyniki badań in vitro zostaną powtórzone w badaniach klinicznych, pacjenci, którzy są nosicielami tych alleli, mogą być potencjalnie słabo metabolizowani przez CYP3A4 i mogą: i) wymagać niższych dawek chininy, aby osiągnąć terapeutyczne stężenia w osoczu; i ii) być narażeni na zwiększone ryzyko działań niepożądanych i toksyczności, gdy stosowane są konwencjonalne dawki chininy.
CYP3A4*2 (S222P) wykazywał ponad sześciokrotnie zmniejszony CLint (14,76%, Tabela 2) dla chininy w porównaniu z dzikim CYP3A4*1A., To zmniejszenie aktywności enzymatycznej może być spowodowane tym, że substytucja aminokwasu seryny→proliny może spowodować poważną zmianę w trójwymiarowej strukturze enzymu (wiadomo, że prolina łamie Alfa-helisy). Podobnie donoszono, że CYP3A4 * 2 wykazuje niższy poziom CLint dla midazolamu(Miyazaki et al., 2008), nifedypina (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018) i lidokainy (Fang et al., 2017), niż enzym typu dzikiego. Natomiast CYP3A4*2 wykazywał wyższy poziom CLint dla amiodaronu (Yang et al., 2019)., W przypadku testosteronu, CYP3A4*2 miał zmniejszony wewnętrzny klirens, gdy wyrażany był za pomocą systemu ekspresji Escherichia coli in vitro (Miyazaki et al., 2008), ale aktywność była porównywalna do enzymu typu dzikiego, gdy wyrażono ją w systemie ekspresji baculovirus (SATA et al., 2000) (Tabela 3).
CYP3A4 * 3 (M445T) wykazywał mniejszą aktywność enzymatyczną wobec chininy w porównaniu z allelem typu dzikiego (Tabela 2)., Pozostałość aminokwasu 445 znajduje się w zakonserwowanym regionie wiązania hemu, tylko dwa aminokwasy C-terminale do absolutnie zakonserwowanego Cys w pozycji 442 w białku CYP3A4 (Sata et al., 2000); dlatego zmiana Met445Thr może wywierać niekorzystny wpływ na Wiązanie hemu, powodując zmianę aktywności katalitycznej enzymu, zwłaszcza gdy wiąże się z odpowiednim substratem. Jednak, jak stwierdzono w tabeli 3, aktywność enzymatyczna CYP3A4*3 była podobna do aktywności enzymatycznej CYP3A4 typu dzikiego dla większości badanych substratów., Rozbieżność wyników może wynikać z różnych metod ekspresji heterologicznej oraz ze zróżnicowanej specyficzności substratu dla wariantu.
CYP3A4*4 (I118V) wykazywał mniejszą aktywność w stosunku do chininy, w stosunku do dzikiego typu CYP3A4*1A. badania mutagenezy ukierunkowanej na miejsce wskazują, że ser119 jest kluczowym aminokwasem występującym jako pozostałość w miejscu aktywnym (Yano et al., 2004). Stąd mutacja Ile118Val może wpływać na konformację miejsca aktywnego, powodując zmniejszenie aktywności katalitycznej., Podobnie, badanie in vivo wykazało, że stosunek poziomu 6β-hydroksykortyzolu w moczu / wolnego kortyzolu u tych heterozygotycznych osób był niższy niż w zdrowych grupach kontrolnych, co sugeruje zmniejszenie aktywności enzymatycznej (Hsieh et al., 2001).
oba warianty CYP3A4*8 i *13 wykazywały wykrywalne, choć niższe, poziomy HOLOPROTEIN CYP3A4 i miały bardzo niską aktywność katalityczną w stosunku do chininy. W przeciwieństwie do naszych wyników, stwierdzono, że CYP3A4*8 i *13 nie wykazują wykrywalnych holoprotein CYP, gdy ulegają ekspresji w układach bakteryjnych (Eiselt et al., 2001)., Spekulujemy, że zastosowanie systemów ekspresji bakterii i owadów może wyjaśniać różne wyniki. System ekspresji bakterii nie posiada wewnątrzkomórkowego środowiska błonowego (Gonzalez i Korzekwa, 1995) wymaganego do wysokiej ekspresji białka. Natomiast komórki owadów mogą przetwarzać i modyfikować białka w sposób podobny do komórek ludzkich, umożliwiając prawidłowe złożenie enzymu i włączenie kofaktora hemu, co powoduje wyższą ekspresję białek CYP3A4.,
CYP3A4 * 11 (T363M) wyrażono na znacznie niższym poziomie niż CYP3A4 typu dzikiego (rycina 2), co jest zgodne z badaniami z wykorzystaniem systemów ekspresji bakterii lub ssaków (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). Treonina w pozostałości 363 w miejscu rozpoznawania substratu (SRS) -5 może przyczyniać się do tworzenia sieci wiązania wodorowego. Zastąpienie treoniny metioniną może spowodować utratę aktywności katalitycznej (Murayama et al., 2002). Tak więc CYP3A4*11 wykazywał zmniejszoną aktywność hydroksylacji chininy w obecnym badaniu., Ponadto CYP3A4 * 11 wykazywał zmniejszoną aktywność hydroksylacji testosteronu (Murayama et al., 2002), znacznie zwiększył CLint w kierunku lidokainy (Fang et al., 2017) i amiodaron (Yang et al., 2019), ale nie było związane z zauważalnymi zmianami w aktywności metabolicznej ibrutinibu (Xu et al., 2018) (Tabela 3).
CYP3A4 * 12 (L373F) wykazywał dramatycznie obniżony poziom Clinta w stosunku do chininy, podobnie jak wcześniejsze wyniki badań nad midazolamem (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4*12 posiada zmianę aminokwasów Leu373Phe; zmutowana pozostałość znajduje się w pobliżu Arg-372 i Glu-374, które biorą udział w tworzeniu sieci wiązania wodorowego i są zaangażowane w aktywne miejsca zgodnie z badaniami obejmującymi mutagenezę ukierunkowaną na miejsce (Yano et al., 2004). W związku z tym pozostałość mutacyjna (L373F) prawdopodobnie wpływa na stabilność sieci wiązania wodorowego i przestrzenną konformację jamy w miejscu aktywnym, powodując zmianę aktywności katalitycznej CYP3A4*12.,
CYP3A4*20 (488 frameshift) wykazywał wyraźnie zmniejszoną ekspresję apoprotein (ryc. 1) i radykalnie zmniejszoną aktywność chininy. Natomiast nie stwierdzono aktywności katalitycznej 1′- i 4-hydroksylacji midazolamu w mikrosomach drożdży lub HEK 293 z ekspresją CYP3A4*20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Te sprzeczne wyniki mogą być przypisane do różnych heterologicznych systemów ekspresji i substratów stosowanych w doświadczeniach. Ponadto stwierdzono, że heterozygota CYP3A4*20, zidentyfikowana u osób z Brazylii, wykazuje zmniejszony klirens układowy ∼1.,9-krotnie dla midazolamu in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Wcześniej postawiono hipotezę, że ta rzadka mutacja może wpływać na fałdowanie białek, inkorporację hemu (Westlind-Johnsson et al., 2006), oraz przestrzenną konformację jamy w miejscu aktywnym, co prowadzi do zmniejszenia lub utraty aktywności katalitycznej związanej z zastosowanym substratem.
CYP3A4 * 21 (Y319C), który został zidentyfikowany w populacji Chińskiej (Zhou et al., 2011), wykazywał słabą aktywność katalityczną w kierunku chininy w naszym badaniu. Co ciekawe, w naszych wynikach nie stwierdzono wykrywalnej ekspresji apoenzymu., Tyr319 jest wysoce zachowaną pozostałością w rodzinie cytochromu P450 podczas ewolucji eukariotów od nicienia do człowieka (Zhou et al., 2011). Zgodnie z przewidywaniami funkcjonalnymi in silico (Zhou et al., 2011), pozostałość Tyr319 leży na ważnej domenie, a zastąpienie Tyr Cys w pozycji 319 białka CYP3A4*21 może wywołać dramatyczne zmiany w konfiguracji jamy w miejscu aktywnym. Dlatego CYP3A4 * 21 Może wytwarzać nieprawidłowe działanie białka o zmniejszonej aktywności katalitycznej w kierunku chininy., Dodatkowo spekulowaliśmy, że przeciwciała, których użyliśmy do wykrycia rekombinowanych APOPROTEIN CYP3A4, mogą nie być odpowiednie do wykrycia wariantu CYP3A4*21. Oznacza to, że mutacja Tyr319Cys w CYP3A4*21 może uniemożliwić tym przeciwciałom rozpoznawanie swoistych epitopów w CYP3A4.
natomiast dwa z rekombinowanych holoenzymów CYP3A4, CYP3A4 * 15 (R162Q) i CYP3A4*29 (F113I), wykazały znamienny wzrost CLint dla chininy. Podobnie, zarówno CYP3A4*15, jak i CYP3A4 * 29 wykazywały zwiększony CLint w kierunku lidokainy (Fang et al., 2017), ale wykazały zmniejszenie CLint dla ibrutinibu (Xu et al., 2018)., CYP3A4 * 15 wykryto najpierw w różnych populacjach etnicznych z małymi próbkami dla każdej grupy etnicznej (Lamba et al., 2002). CYP3A4 * 29 został zidentyfikowany i nazwany w naszym niedawnym badaniu (Hu et al., 2017). Oba warianty są związane z szybkim metabolizmem chininy in vitro. Jeśli u osób, które są homozygotycznymi lub heterozygotycznymi nosicielami CYP3A4*29 lub CYP3A4 * 15 zostanie stwierdzone potwierdzenie zwiększonego klirensu chininy, osoby te mogą być ultraszybkimi metabolizmami chininy przez CYP3A4., Pacjenci z tymi genotypami mogą: i) wykazywać mniejszą skuteczność terapeutyczną, gdy podaje się zwykle kliniczne dawki chininy; i ii) wymagać większych dawek, aby osiągnąć terapeutyczne stężenia w osoczu.
nie wykryto aktywnych holoenzymów wariantów CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop) i CYP3A4*30 (r130stop), w związku z czym nie wykazywały one aktywności metabolicznej chininy (Tabela 2).,
CYP3A4*6 ma insercję pozostałości adeniny w eksonie 9 (830-831 insA); ta mutacja powoduje przesunięcie ramki i prowadzi do translacji obciętego białka, które nie może zawierać hemu (Hsieh et al., 2001). W związku z tym w naszym badaniu nie zidentyfikowano aktywności katalitycznej CYP3A4*6 w kierunku chininy. Jak wykazano wcześniej in vivo, u Chińczyka stwierdzono heterozygotyczność CYP3A4 * 6 ze znacznie niższym stosunkiem poziomu 6β-hydroksykortyzolu w moczu: wolnego kortyzolu niż u osób z dzikim typem, co sugeruje zmniejszoną aktywność CYP3A4 (Hsieh et al., 2001)., Podobnie u pacjenta, który jest heterozygotyczny dla CYP3A4*6, poddawanego transplantacji narządów, stosunek stężenia takrolimusu do dawki dostosowanej był 4, 3 razy większy niż u pacjentów z typem dzikim (Jun i wsp., 2009).
CYP3A4*26 ma podstawienie nukleotydu C→T w eksonie 5. Powoduje to zmianę z argininy na przedwczesny kodon stop w pozycji 268 i powoduje przypuszczalne skrócone białko pozbawione domeny katalitycznej, a tym samym aktywność (Werk et al., 2014)., CYP3A4 * 26 może nie być wyrażony z powodu przedwczesnego kodonu stop w pozycji 268 lub, jeśli tak jest, białko może być oznaczone do szybkiej degradacji (Werk et al., 2014). W związku z tym nie byliśmy w stanie wykryć holoproteiny odmiany CYP3A4*26 wyrażonej w komórkach Sf21. Podobnie, U 19-letniego pacjenta po przeszczepieniu nerki, zidentyfikowanego jako homozygota dla CYP3A4 * 26, a w międzyczasie również homozygota dla CYP3A5*3, stwierdzono nieoczekiwanie wysokie stężenie takrolimusu w osoczu w wyniku bardzo zmniejszonego klirensu takrolimusu (Werk et al., 2014).,
podobnie jak CYP3A4*26, CYP3A4*30 mA zmianę z argininy na przedwczesny kodon zatrzymania w pozycji 130 (Hu i wsp., 2017). Arg130 jest uważany za ważny dla włączenia hemu (Eiselt et al., 2001), a zatem mutacja Arg130 zaburzyłaby inkorporację hemu i w ten sposób wpłynęłaby na ekspresję holoenzymu CYP3A4.
w połączeniu z poprzednimi badaniami (Tabela 3), niektóre warianty alleliczne CYP3A4 wykazały różne preferencje dla substratów w przeciwieństwie do enzymów typu dzikiego. Mianowicie, niektóre warianty wykazują zmienione działania katalityczne o Profilu zależnym od substratu., Jak wspomniano powyżej, sprzeczne wyniki pochodzące z określonego substratu w badaniach mogą wynikać z wielu czynników, takich jak rozbieżności z metodą in vitro lub in vivo i różnych heterologicznych systemów ekspresji.
chinina ma częste działania niepożądane ,ze względu na wąski indeks terapeutyczny (Bateman and Dyson, 1986). Te działania niepożądane były wywoływane nie tylko przez leki, ale także przez zwykłe napoje zawierające chininę., Na podstawie systematycznego przeglądu danych klinicznych z STU czternastu artykułów, działania niepożądane, które były spowodowane napojami zawierającymi chininę, stanowiły 20% wszystkich działań niepożądanych chininy (Liles et al., 2016). Zaskakująco, nawet przy niewielkiej ekspozycji od zwykłych napojów, niektóre osoby doświadczyły ciężkich działań niepożądanych obejmujących wiele układów narządów. Biorąc pod uwagę oczywistą międzyosobniczą różnorodność wrażliwości na chininę, zmiany w CYP3A4 mogą być jednym z możliwych mechanizmów leżących u podstaw wrażliwości na chininę i działań niepożądanych., Ponadto przepisy dotyczące stosowania chininy nie zostały ustanowione w niektórych krajach, na przykład tabletki zawierające 50 mg lub mniej chininy są uważane za naturalny produkt zdrowotny i są dostępne bez recepty w Kanadzie (Liles et al., 2016); płyny i szampony zawierające chininę, a także napoje zawierające chininę, pozostają powszechnie dostępne i nadzór nie jest wymagany. Uważa się zatem, że konieczna jest większa świadomość międzyosobniczych różnic w wrażliwości chininy i niepożądanych reakcji na chininę wśród lekarzy i społeczeństwa.