przeciwmitochondrialne autoprzeciwciała w toczniu rumieniowatym układowym i ich związek z objawami choroby
zatwierdzenie badania
populacja pacjentów
surowice ludzkie przebadane w tym badaniu zostały uzyskane z zatwierdzonego badania University Health Network Research ethics board (Reb) z udziałem pacjentów z SLE i APS w Toronto, a także od zdrowych pacjentów z grupy kontrolnej i pacjentów z PBC rekrutowanych z CHU de Québec-Université Laval Reb w mieście Quebec., Pacjenci z SLE musieli spełniać kryteria klasyfikacji ACR dla SLE z 1982 r., zrewidowane w 1997 r. 81,82, a pacjenci z APS z Sapporo z 1999 r., zrewidowane w 2006 r. 83,84. W przypadku SLE, kolejne pacjentki z University of Toronto Lupus Clinic (UTLC) zostały poproszone i udzieliły zgody między sierpniem 2010 a październikiem 2011, aby wziąć udział w badaniu dotyczącym roli kwasów tłuszczowych i chorób układu krążenia w toczniu. Dostarczyli jedną próbkę krwi i mieli anonimowe dane kliniczne powiązane z ich biospecimenem., Podobnie pacjenci z APS Obserwowani w klinice reumatologii w Toronto byli traktowani zgodnie z podobną procedurą. Wszystkie pozostałe biospecimeny mogą być wykorzystane do przyszłych badań nad biomarkerami tocznia zgodnie z pierwotną zgodą badanych. W ramach badania markerów stanu zapalnego rekrutowano zdrowych ochotników z grupy kontrolnej, którzy nie mieli znanych chorób i nie mieli objawów zakaźnych w czasie pobierania krwi. W tym czasie zebrano wiek i płeć. Pacjenci z PBC spełniali kryteria klasyfikacji PBC z 2009 r., zrewidowane w 2018 r. 38,85, w tym dodatni wynik dla przeciwciał przeciw mitochondrialnych.,
dane z laboratoriów klinicznych
u pacjentów z SLE anty-dsDNA mierzono za pomocą testu Farr (laboratoryjna wartość graniczna wynosząca 30%), a antykardiolipiny (laboratoryjne wartości graniczne IgG i IgM wynoszące 40 jednostek GPL lub MPL) mierzono za pomocą testu ELISA w laboratorium klinicznym.
hodowla komórkowa
indukcyjny model myszy SLE
, C57BL / 6 J zostały pozyskane z Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) i umieszczone w elitarnym, wolnym od patogenów zakładzie dla zwierząt w CHU de Quebec. U tych myszy indukowano autoprzeciwciała SLE, jak wcześniej opisano 63. Krótko mówiąc, 6-8-tygodniowe samce myszy otrzymały 100 µL IV.iniekcji ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA), a następnie 24 godziny później 100 µL IV.iniekcji lipopolisacharydu (LPS od E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Wstrzyknięcia te powtarzano po 2 i 4 tygodniach przez łącznie trzy rundy szczepień, a myszy wykrwawiano 48 godzin po trzecim szczepieniu. Mysz C57BL/6 J wstrzykiwana dożylnie z PBS według tego samego schematu była używana jako kontrolna.
Etyka
w trakcie całego badania pobierano próbki krwi od pacjentów za świadomą zgodą. Wszystkie metody przedstawione w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi dawców ludzkich i mysich.,
izolacja mitochondriów
Mitochondria wyizolowano z wątroby myszy C57BL / 6 J w wyniku połączenia opublikowanych protokołów 61,62. Myszy zostały uśmiercone przez zwichnięcie szyjki macicy, szybko usunięto wątrobę, wycięto pęcherzyk żółciowy, a wątrobę przepłukano lodowatym PBS (137 mM NaCl, 3 mm KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mm KH2PO4)., Wątroba została następnie mielona i przeniesiona do wstępnie schłodzonej szklanej / teflonowej maszynki do mielenia tkanek zawierającej 12 mL zimnego bufora izolacji mitochondrialnej (10 mm Tris, 1 mm EGTA, 200 mM sacharozy) na gram wątroby, a następnie zmielona do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Nienaruszone komórki i jądra granulowano dwukrotnie w temperaturze 700 g, 4 °C, 10 min. Zanieczyszczenia błon, białek i organelli zostały wyeliminowane przez dwie wirowanie w temperaturze 7000 g, 4 °C, 10 min, a następnie wirowanie w temperaturze 10000 g, 4 °C, 10 min., Surowa zawiesina mitochondrialna została dodatkowo oczyszczona przez ultracentryfugację na gradient Percolla (10 mm Tris, 1 mm EGTA, 30% V:V Percoll) przy 95 000 g, 4 °C, 30 min. Zespół zawierający mitochondria zebrano w PBS. Podobne podejście zastosowano w celu wyizolowania ludzkich mitochondriów z tym wyjątkiem, że aż 107 komórek Hep-G2 było lizowanych przez powtarzające się przejścia przez igłę o wąskim przekroju., Komercyjny kit QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Niemcy) został również użyty, zgodnie z instrukcjami producenta, do izolacji mitochondriów z komórek Hep-G2 w celu porównania jakości przez Western blotting z wyżej wymienionym protokołem. Izolowane mitochondria dawkowano metodą kwasu bicynchonicznego (BCA) przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA). Świeżo wyizolowane mitochondria były wykorzystywane we wszystkich eksperymentach, z wyjątkiem preparatów cząsteczek submitochondrialnych, dla których peletowane mitochondria były przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu potrzebnego.,
przygotowanie cząsteczek Submitochondrialnych (SMP)
SMP zostały przygotowane zgodnie z opisem. Na krótko zamrożone mitochondria rozmrażano w temperaturze pokojowej i rozcieńczano do 10 mg białek mitochondrialnych w 10 mM kwasie 4-Morfolinepropanosulfonowym (MOPS). Próbki były następnie sonikowane przy użyciu Fisher Sonic Dismembrator Model 500 (Thermo Scientific) przy maksymalnej wydajności 20% przez 20 sekund, a następnie przechowywane w słonej kąpieli wodnej przez 10 minut. Cykl ten powtórzono dziewięciokrotnie., Następnie próbki odwirowano w temperaturze 16 000 g, 4 °C, 10 minut w celu usunięcia nieprzerwanych mitochondriów i innych niechcianych zanieczyszczeń. Supernatanty zbierano w świeżej probówce, a ich objętość dostosowano do 2 mL w mopach 10 mM. Następnie próbki poddano ultracentryfikacji w temperaturze 150 000 g, 4 °C przez 45 minut. Granulowany SMP wymieszano w buforze SMP (225 mm mannitolu, 75 mM sacharozy, 10 mm HEPES, 0,1 mm EDTA, pH 7,4) i podawano. Preparaty SMP były przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu, gdy było to konieczne.,
preparat mikrocząsteczek czerwonych krwinek (rbcmp)
erytrocyty (RBC) wyizolowano z krwi zdrowych ochotników przez odwirowanie w dawce 282 g przez 10 minut w radioterapii. Policzono RBC (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) i dostosowano do stężenia 5 × 108 komórek/mL w buforze Tyrode (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mm KCl, 0,5 mm NaH2PO4, 1 mm MgCl2, 5 mm glukozy, 10 mm HEPES, pH 7,4)., Następnie 109 komórek rozcieńczono w 45 mL podwójnie destylowanej wody i inkubowano przez 5 minut. Toniczność bufora została następnie zrównoważona przez dodanie 5 ml PBS 10X (filtrowanego przez membranę 0,22 µm). Pozostałości RBC zostały usunięte przez odwirowanie w temperaturze 1300 g przez 5 minut w RT, A supernatant odwirowano w temperaturze 18 000 g przez 90 minut w temperaturze 18 °C. granulat mikrocząsteczek RBC zawieszono następnie w 500 µl PBS. Stężenie białka oznaczano metodą BCA.,
Western blotting
pomiar wielkości mitochondriów za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
rozmiar izolowanych mitochondriów został zmierzony za pomocą DLS, przy użyciu urządzenia Zetasizer Nano ZS (Malvern instruments, Malvern, UK) wyposażonego w standardowy laser He-Ne o mocy 4 mW, 633 nm jako źródło światła, ustawiony pod kątem detekcji 173°. Eksperymenty replikowano trzykrotnie w jednorazowych kuwetach UV o długości 1 cm (Brand GMBH, Wertheim, Niemcy) zawierających 100 µL izolowanych mitochondriów mysich rozcieńczonych w PBS w stężeniu 10 µg białek/µL., Przy pomiarze wielkości mitochondriów brano pod uwagę następujące parametry: współczynnik załamania rozpuszczalnika: 1,330, lepkość próbki: 0,8872 mPas, współczynnik załamania białek: 1,45, temperatura: 25 °C.
mikroskopia elektronowa
Mitochondria (108) były utrwalane w 3,5% akroleinie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Próbki stałe płukano dwukrotnie w PBS, a następnie osadzano w 4% agarozie. Sekcje 50 µm były cięte za pomocą wibratomu, po utwardzeniu w 1% tetroksydzie osmu przez 30 minut i osadzone w żywicy Durcupan., Siedemdziesiąt nanometrowych ultracienkich sekcji wizualizowano przy 80 kV za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego tecnai G2 Spirit Bitwin (Fei, Hillsboro, OR, USA).
ocena zużycia tlenu w mitochondriach
Mitochondria wymieszano w roztworze do badania mitochondrialnego (MAS: 70 mm sacharoza, 220 mm mannitol, 10 mm KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mm HEPES, 1 mm EGTA i 0,2%(w/v) bezkwasowych kwasów tłuszczowych BSA, pH 7,4 w temperaturze 37 °C) i uzupełniono 10 mM pirogronianem, 2 mm jabłczanem i 4 µM FCCP , pH 7.4. Odpowiednik 10 µg białka został zaszczepiony na płytkach XF-96 (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Płytki odwirowywano 2000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. wizualizowaliśmy rozkład mitochondriów pod mikroskopem jasnego pola, aby zapewnić przyczepność i jednorodną repartycję. Płyty utrzymywano w temperaturze 37 °C bez CO2 przez około 40 minut przed załadunkiem. Wskaźniki zużycia tlenu (OCR) zostały zmierzone zgodnie z instrukcjami producenta (Agilent/Seahorse Bioscience). Eksperymenty były replikowane w trzech studniach i uśrednione dla każdego warunku eksperymentalnego., Łącznie wykonano 3 pomiary zużycia tlenu dla każdego stanu w przybliżeniu co 6 minut w Warunkach podstawowych i po dodaniu kolejno rotenonu( 2 µM), bursztynianu (10 mM), antymycyny A (40 µM) i TMPD (N,N,N', N'-tetrametylo-p-fenylenodiaminy)/askorbinianu (100 µM/10 mM). Bursztynian był stosowany jako donor elektronów dla kompleksu II, rotenon jako inhibitor kompleksu i, antymycyna A jako inhibitor kompleksu III, a oddychanie przez kompleks IV oznaczano za pomocą TMPD/askorbinianu.,
cytometria przepływowa o wysokiej czułości
ze względu na swoje niewielkie rozmiary, mitochondria zostały wykryte za pomocą cytometrii przepływowej o wysokiej czułości, przy użyciu „opcji małych cząstek” składającej się z rozpraszacza do przodu (FSC) sprzężonego z lampą fotopowielacza (PMT) zamontowaną na specjalnym produkcie badawczym BD FACS Canto II (SORP, BD Biosciences). Mitochondria (0,5 µg) zostały zabarwione 1 µg anti-TOMM22-Atto 488 (clone IC9-2, Sigma-Aldrich) i 1 µM mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) przez 30 minut w temperaturze 37 °C i rozcieńczone PBS do ostatecznej objętości 500 µl przed analizą cytometrii przepływowej., Do ilościowego pomiaru liczby mitochondriów użyliśmy mikrosfery polistyrenowej o średnicy 3 µm (Polysciences, PA, USA). Do każdej próbki dodano 80 000 mikrosfer i pozyskano 500 mikrosfer. Cząstki krzemionki (Kisker Biotech, Steinfurt, Niemcy) zostały użyte do określenia skali wielkości 100-1000 nm.
ekstrakcja mitochondrialnego DNA metodą lizy zasadowej
izolowane mitochondria były granulowane w temperaturze 10 000 g, 4 °C, 10 min i wymieszane w 0,8 mL bufora izolacyjnego mtDNA A na każde 3 mg białek mitochondrialnych., Mitochondria były następnie Liz w jednej objętości (V:v) mtDNA bufor izolacyjny B (przygotowany ekstemperaturowo. 0,2 M NaOH, 1% SDS) przez 3 min. na lodzie, pod delikatnym pobudzeniem. zawiesiny mtDNA zneutralizowano jednym objętościowym (v:v) buforem izolacyjnym mtDNA C (octan potasu 1,32 M, pH 4,8 skorygowane lodowatym kwasem octowym) przez 5 min. na lodzie, pod delikatnym pobudzeniem. Szczątki mitochondrialne były granulowane przez odwirowanie przez 10 minut w ilości 14 000 g, RT. Supernatanty były przenoszone do świeżych probówek. mtDNA wytrąca się przez noc w temperaturze -20 °c z 0.,1 objętość (v:v) octanu potasu (roztwór podstawowy: 3 M octanu sodu, pH dostosowane do 5,2 z zimnym kwasem octowym) i 0,7 objętości (V:v) absolutnego izopropanolu. mtDNA następnie granulowano w dawce 14 000 g, trzykrotnie przemyto 1,5 mL 70% etanolu i ponownie wymieszano w buforze do resusspension DNA (10 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, pH 8,0). Stężenie mitochondrialnego DNA oznaczono metodą spektrofotometrii (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
izolacja jąder z mysich hepatocytów
Jądra wyizolowano z mysich wątroby za pomocą opublikowanych metod86., Krótko mówiąc, podczas protokołów izolacji mitochondriów, podczas gdy supernatanty były używane do wykonywania izolacji mitochondriów, granulki z pierwszej wirówki 700 g były ponownie zawieszane w 10 mL zimnego bufora izolacyjnego jąder a (5 mm MgCl2, 10 mm Tris-HCl, 250 mM sacharozy. pH 7,4) i zmielone w wstępnie schłodzonej szlifierce do tkanek szklanych/teflonowych. Zawieszenie zostało dodatkowo zakłócone przez trzy przejścia przez igłę o kalibrze 25 G5/8, a następnie przez dwa przejścia przez igłę o kalibrze 27 g½., Zawiesinę następnie filtrowano na sitku komórkowym z nylonu 40 µM (Thermo Fisher Scientific) i odwirowywano w temperaturze 600 g, 4 °C, 10 min. Granulki wymieszano w 14 mL bufora A i odwirowano w temperaturze 600 g, 4 °C, 10 min. Granulki były następnie ponownie zawieszane w 9 tomach lodowatego bufora izolacyjnego jąder B (1 mM MgCl2, 10 mm Tris-HCl, 2,0 M sacharozy. pH 7,4) i odwirowane w temperaturze 16 000 g, 4 °C, 30 min. Granulki wymieszano w 200 µL PBS i przechowywano w temperaturze -20 °C.,
Izolacja DNA z całych komórek i jąder komórkowych
DNA z 25 mg całej wątroby myszy lub 200 µL lub izolowanych jąder zostało wyekstrahowane przy użyciu Qiamp® DNA Mini Kit (QIAgen), zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki były eluowane w buforze resuspension DNA.,
wzbogacenie mitochondrialnego DNA i jądrowego DNA za pomocą qPCR
trzydzieści nanogramów mitochondrialnego DNA, jądrowego DNA lub takiej samej ilości całkowitego DNA wyekstrahowanego z całej wątroby myszy przy użyciu wyżej wymienionych protokołów zostało amplifikowanych w genie Q real time qPCR cycler (QIAgen) zgodnie ze standardowymi protokołami z SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) w objętości reakcji 10 µL., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
mitochondrialne trawienie DNA przez enzymy restrykcyjne
oczyszczona mysi mtDNA była trawiona przez endonukleazy restrykcyjne Hae II lub PST i (NEB, Whitby, ON, Kanada) zgodnie z protokołem producenta. Następnie przetrawione produkty (1,5 µg) rozpuszczono w 0,5% (m/v) żelu agarozowym. Obrazy pozyskano w systemie dokumentacji Chemidoc MP gel (Bio-Rad). Pełnowymiarowy żel przedstawiono na rysunku dodatkowym. 6d.,
leczenie nukleazami S1 DNA mitochondrialnego i DNA jądrowego
30 µg mtDNA i ndna rozcieńczono w 200 µL 1x buforu S1 i poddano działaniu 50 u nukleazy S1 (Thermo Fischer Scientific) przez 5 minut w temperaturze 37 °C. reakcję zatrzymano przez dodanie 600 mM EDTA (stężenie końcowe) i inkubację w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Próbki wytrącano przez dodanie 300 mM octanu sodu (stężenie końcowe) i 2 objętości (v:v) etanolu absolutnego przez 16 godzin w temperaturze -20 °C., Próbki granulowano w 14 000 g, RT, 20 minut, przemyto 1 mL 70% etanolu i wymieszano w buforze do resusspension DNA. W przypadku testów konkurencyjnych nieleczone nDNA i mtDNA były stosowane w tym samym leczeniu bez dodawania enzymu. Próbki były dozowane przez qPCR.
utlenianie mitochondriów in-vitro
podawane mitochondria były granulowane i wymieszane w stężeniu 1,5 mg białek mitochondrialnych/mL w PBS zawierającym 500 µM utleniacza hydroperoxide tertbutylu (Tbhp) (Sigma-Aldrich)., Mitochondria były utleniane przez 1 h 30 min w temperaturze 37 °C pod delikatnym mieszaniem, a następnie dwukrotnie płukane lodowatym PBS. Utlenione mitochondria były następnie oznaczane przez BCA.
utlenianie lipidów mitochondrialnych
tworzenie substancji reaktywnych kwasu Tiobarbiturowego (tbars) oceniono przy użyciu zestawu parametrów TBARS (R&D systems, Minneapolis, MN, USA), zgodnie z instrukcjami producenta. 200 mikrogramów mitochondriów poddano lizie, białka wytrącono przy użyciu kwasu trichlorooctowego (TCA) i granulowano w temperaturze 12 000 g, w temperaturze pokojowej, 4 min., Supernatanty zostały przeniesione do świeżych probówek. Próbki (75 µL) inkubowano 37,5 µL kwasu tiobarbiturowego w 96-studziennej płytce przez 3 godziny w temperaturze 50 °C. absorpcje odczytywano przy 532 nm na czytniku mikropłytek SpectraMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), a oznaczanie tbars przeprowadzono przy użyciu standardowej krzywej dostarczonej w zestawie. Próbki utlenione porównano z mitochondriami kontrolnymi, które inkubowano w tych samych warunkach w PBS pozbawionym TBHP.,
utlenianie białek mitochondrialnych
tworzenie się cząsteczek karbonylowych w wyniku utleniania mitochondrialnego in vitro mierzono za pomocą zestawu do oznaczania zawartości karbonylu w białkach (Sigma Aldrich) zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki utlenione porównano z mitochondriami kontrolnymi, które inkubowano w tych samych warunkach w PBS pozbawionym TBHP.,
wykrywanie przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom mitochondrialnym metodą ELISA
w celu wykrycia przeciwciał anty-całych mitochondriów (AwMA), mysie mitochondria rozcieńczono (500 µg/mL) w buforze węglanowo-wodorowęglanowym 50 mM, pH 9,6 i 25 µL na studnię załadowano na 96-studzienne, przezroczyste, płaskie polistyrenowe mikropłytki o wysokim wiązaniu (Corning, Nowy Jork, USA). Płytki powlekano przez 18 h w temperaturze 4 °C, a następnie blokowano przez 4 h w temperaturze 37 °C z PBS zawierającym 10% FBS i 0,5% żelatyny. Po trzech myciach PBS surowica rozcieńczona 1:150 (o ile nie określono inaczej) w PBS-10% FBS-0.,3% żelatyny inkubowano przez noc w temperaturze 4 °c w dwóch egzemplarzach. Po trzech myciach z PBS, płytki inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej fosfatazą alkaliczną-skoniugowaną kozą przeciw mysią lub antyludzką IgG (Sigma-Aldrich) rozcieńczoną 1:1000 w PBS-0,4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Płyty zostały trzykrotnie przemyte PBS i opracowane z fosforanem P-nitrofenolu (P-NPP) przez ~30 min w temperaturze 37 °C, a gęstości optyczne (OD) odczytywano przy 405 nm na czytniku mikropłytkowym., Ten sam protokół został użyty do wykrywania autoprzeciwciał ukierunkowanych na cząsteczki submitochondrialne za pomocą 25 µL na odwiert SMP rozcieńczonego (50 µg / mL) w 50 mM buforze węglanowo-wodorowęglanowym, pH 9,6. Podobne podejście zastosowano w mitochondriach ludzkich z następującą modyfikacją: płytki inkubowano przeciwciałem wtórnym IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1: 3 000), aktywność peroksydazy ujawniono w temperaturze pokojowej przez ~5 min z 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyną (TMB). Reakcję zatrzymano przy 2 N H2SO4 i odczycie ODs przy 450 nm., W przypadku testu ELISA anty-mtDNA płytki były wstępnie powlekane 1% siarczanem protaminy w wodzie podwójnie destylowanej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płyty trzykrotnie przemyto PBS i powlekano przez noc w temperaturze 4 °C 400 ng mtDNA w PBS. Wszystkie kolejne etapy były identyczne z tymi stosowanymi w AwMA-ELISAs. Wartości ślepej próby (antygeny mitochondrialne i brak surowic) od wartości mierzonych dla każdego pacjenta odejmowano. W trakcie opracowywania tych testów badano właściwą powłokę studni za pomocą przeciwciał monoklonalnych dopasowanych do izotypu myszy (mAb). Przeciwciało monoklonalne (klon IV.,3, 4 µg / mL) w każdym przypadku stosowano jako ujemną kontrolę testu, podczas gdy różne przeciwciała monoklonalne, w zależności od antygenów otoczki, były dodatnimi kontrolami testu: anty-TOMM22 mAb (Klon IC9 – 2, 4 µg / mL. Abcam) dla nienaruszonych mitochondriów, anty-DNA MAB (klon 35I9 DNA, 10 µg / mL. Abcam) lub anty-cytochromu C mAb (Klon 7H8.2c12, 5 µg/mL. BD Biosciences).,
Test konkursowy
Awma-Elisa przeprowadzono zgodnie z opisem w poprzednich punktach z następującymi modyfikacjami: próbki surowicy były wstępnie inkubowane w buforze rozcieńczania (1:150) z różnymi stężeniami (0,25, 1 i 3 mg / mL) konkurentów (tj. mitochondriów lub mikrocząsteczek czerwonych krwinek) przez 3 godziny. w RT i inkubowane w dwóch egzemplarzach przez noc w temperaturze 4 °C. dane są przedstawiane jako odsetek sygnału pozostałego po każdej konkurencji, w porównaniu do OD (405 nm) mierzonego pod nieobecność konkurentów.,
podobną procedurę zastosowano dla AmtDNA-ELISA, stosując zwiększone stężenia (0, 3, 9 i 27 ng/µL) konkurencyjnego DNA (wyekstrahowanego z jąder lub mitochondriów, z leczeniem nukleazą S1 lub bez niej).
Statystyka
porównań pomiędzy grupami dokonano za pomocą testu t Studenta, testu Wilcoxona, testu Friedmana lub Kruskala-Wallisa, jednokierunkowego testu ANOVA, dwukierunkowego lub powtarzanego testu ANOVA w zależności od wyniku, a także liczby i rodzaju grup., Gdy wielokrotne porównania oceniano, odpowiednie post-hoc testy korekcyjne zostały wykorzystane, takie jak Dunn, Dunnett, Sidak lub Bonferroni ' s. skojarzenia między AwMA, AmtDNA i anty-hsp60 zostały obliczone z korelacji Spearmana. Dystrybucja tych przeciwciał zgodnie z wynikami ACA porównano za pomocą testu Wilcoxona. Skojarzenia pomiędzy AwMA lub AmtDNA a wynikami klinicznymi badano za pomocą dwu-i wielowymiarowych regresji liniowych i logistycznych., Badane wyniki kliniczne to średnia grubość nośnika intima, procentowa zmiana rozszerzania (FMD) tętnicy ramiennej za pośrednictwem przepływu, obecność FMD, obecność płytki nazębnej w tętnicy szyjnej, Zdarzenie zakrzepowe ever, liczba białych krwinek, liczba płytek krwi, zwiększone Wiązanie DNA metodą Farr powyżej normalnego zakresu badania laboratoryjnego, obecność uszkodzeń według Slicc Damage Index (SDI > 0), wysoka aktywność według sledai-2K activity score (SLEDAI ≥ 4), obecność toczniowego zapalenia nerek, Klasa biopsji, a także wskaźnik przewlekłości i aktywności z biopsji., Te ostatnie zostały dostosowane do czasu trwania choroby, wieku, wskaźnika masy ciała (BMI), cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL), leków przeciwmalarycznych i prednizonu. Regresje logistyczne są przedstawiane z nieparzystymi wskaźnikami i ich 95% przedziałem ufności Wald. Wyniki uczestników uznano za pozytywne dla AwMA i AmtDNA, gdy ich wartość była powyżej wartości odcięcia zidentyfikowanej po zmaksymalizowaniu indeksu Youdena. Dla odcięcia uzyskano 95% przedział ufności przy użyciu 10 000 próbek bootstrap. Miary wydajności przedstawiono z dokładnym przedziałem ufności wynoszącym 95%.,
oprogramowanie
migrację mtDNA poprzez żel agarozowy obrazowano za pomocą Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). Badania DLS przeprowadzono przy użyciu wbudowanego oprogramowania Zetasizer 7.10 (Malvern Instruments). Obrazy EM zostały nabyte za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazu 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). Cytometrię przepływową przeprowadzono przy użyciu BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biosciences). Plony z wyizolowanych DNA określono ilościowo za pomocą ND-1000 3.8.,1 oprogramowanie (Thermo Fisher Scientific)i qPCR zostały wykonane z RotorGene 6.1 (Corbett Research / QIAgen). Gęstości optyczne mierzono za pomocą SoftMax Pro 5.4.1 (urządzenia molekularne). Dane zostały zmontowane z ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) i Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA). Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania Prism 7 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) oraz Sas w wersji 9.4 (SAS Institute Inc ., Cary, NC, USA).