Anti-mitocondrial de auto-anticorpos no lúpus eritematoso sistémico, e sua associação com as manifestações da doença
Estudo aprovação
população
Os humanos de sera testado neste estudo foram obtidos a partir de uma Universidade a Rede de Saúde de ética em pesquisa do conselho (REB) aprovado o estudo de SLE e APS pacientes em Toronto, bem como de controles saudáveis e pacientes PBC recrutados a partir de CHU de Québec – Université Laval REB aprovado estudos na Cidade de Quebec., Os doentes com SLE tinham de cumprir os critérios de classificação ACR de 1982 para o SLE revistos em 199781,82 e os doentes APS cumpriam os critérios Sapporo de 1999 para o APS revistos em 200683,84. Para o SLE, consecutivos de pacientes do sexo feminino da Universidade de Toronto Lúpus Clínica (UTLC) foram abordados e consentimento entre agosto de 2010 e outubro de 2011 para ser parte de um estudo sobre o papel dos ácidos graxos e doenças cardiovasculares no lúpus. Eles forneceram uma amostra de sangue e tinham os seus dados clínicos anónimos ligados aos seus biospecimes., Da mesma forma, os pacientes APS vistos na clínica de Reumatologia em Toronto foram abordados seguindo um procedimento semelhante. Todos os biospecimen restantes podem ser utilizados em estudos futuros sobre biomarcadores de lúpus, de acordo com o consentimento dos indivíduos originais. Voluntários saudáveis do controle foram recrutados como parte do estudo sobre marcadores de inflamação se eles não tinham doenças conhecidas e não tinham sintomas infecciosos no momento da colheita de sangue. A idade e o Sexo foram coletados naquela época. Os doentes com hemograma completo cumpriram os critérios de classificação de 2009, revistos em 201838,85, incluindo a positividade para anticorpos anti-mitocondriais.,dados de laboratórios clínicos
para doentes com LES, os anti-dsDNA foram medidos utilizando o ensaio Farr (corte laboratorial de 30%) e os anti-cardiolipina (IgG e IgM – laboratory cut-offs de 40 unidades GPL ou MPL) foram medidos por ELISA num laboratório clínico.as recomendações do Conselho Canadiano de Cuidados com os animais foram seguidas num protocolo aprovado pelo Comité do bem-estar dos animais da Université Laval., C57BL / 6 J foram obtidos dos laboratórios Jackson (Bar Harbor, ME, USA) e alojados em uma Elite-mais específico-livre de patógenos animais em CHU de Quebec. Foram induzidos auto-anticorpos SLE nestes ratinhos, tal como descrito anteriormente 63. Em resumo, os ratos machos de 6 a 8 semanas receberam 100 µL I. V. injecções de ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, EUA), seguidas 24 h depois de uma injecção de lipopolissacarídeo de 100 µL I. V. (LPS de E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, EUA)., Estas injecções foram repetidas após 2 e 4 semanas para um total de três rodadas de imunizações e os ratinhos sangraram 48 horas após a terceira imunização. Foram utilizados como controlos ratos C57BL / 6 J injectados I. V. com PBS no mesmo esquema.durante todo o estudo, foram obtidas amostras de sangue de doentes com consentimento informado. Todos os métodos apresentados neste estudo foram realizados de acordo com as orientações e regulamentos relevantes para dadores humanos e dadores de murinos.,as mitocôndrias foram isoladas dos fígados de ratos C57BL/6 J, após uma combinação de protocols61,62. Os ratos foram sacrificados por luxação cervical, o fígado foi rapidamente removido, a vesícula excisada e o fígado foi enxaguado em PBS gelados (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., O fígado foi então picado e transferido para uma trituradora pré-arrefecida de tecido de Vidro/Teflon contendo 12 mL de tampão de isolamento mitocondrial a frio gelo (Tris de 10 mM, EGTA de 1 mM, 200 mM de sacarose) por grama de fígado depois moído até se obter uma suspensão homogénea. As células intactas e os núcleos foram tratados duas vezes a 700 g, 4 ° C, 10 min. Membranas contaminantes, proteínas e organelas foram eliminadas por duas centrifugações a 7.000 g, 4 °C, 10 min seguida por uma centrifugação a 10.000 g, 4 °C, 10 min., A suspensão mitocondrial em bruto foi purificada por ultracentrifugação contra um gradiente Percoll (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v:v Percoll) a 95,000 g, 4 °C, 30 min. A banda contendo mitocôndrias foi coletada na PBS. Uma abordagem semelhante foi utilizada para isolar a mitocôndria humana, com a excepção de que até 107 células Hep-G2 foram lisadas por passagens repetidas através de uma agulha de bitola estreita., O kit comercial QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Alemanha) foi também utilizado, de acordo com as instruções do fabricante, para isolar as mitocôndrias das células Hep-G2 para comparação de qualidade por coagulação ocidental com o protocolo acima mencionado. As mitocôndrias isoladas foram administradas pelo método do ácido bicinchonínico (BCA) utilizando o Kit de doseamento proteico BCA (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, EUA). Foram utilizadas mitocôndrias recentemente isoladas em todos os experimentos, com exceção das preparações de partículas submitocondriais para as quais as mitocôndrias peletadas foram mantidas a -80 °C até serem necessárias.,
preparação de partículas Submitocondriais (PMS)
p > SMP foram preparadas de acordo com as outras instruções. Brevemente, as mitocôndrias congeladas foram descongeladas à temperatura ambiente e diluídas a 10 mg de proteínas mitocondriais em ácido 4-Morfolinepropanossulfónico de 10 mM (MOPS). Samples were then sonicated using a Fisher Sonic Dismembrator Model 500 (Thermo Scientific) at 20% maximal output for 20 seconds then keep on a salt-ice water bath for 10 minutes. Este ciclo foi repetido nove vezes., As amostras foram então centrifugadas a 16.000 g, 4 ° C, 10 minutos, a fim de descartar mitocôndrias ininterruptas e outros detritos indesejados. Os sobrenadantes foram recolhidos num tubo fresco e os seus volumes ajustados para 2 mL em esfregaços de 10 mM. As amostras foram então ultracentrifugadas a 150.000 g, 4 ° C durante 45 minutos. A solução de SMP granulada foi ressuspendida em tampão de SMP (225 mM manitol, 75 mM de sacarose, 10 mM de HEPES, 0, 1 mM de EDTA, pH 7, 4) e administrada. As preparações SMP foram mantidas a -80 °C até serem necessárias.,as micropartículas (RBCMP) da preparação dos glóbulos vermelhos (RBC) foram isoladas do sangue de voluntários saudáveis por centrifugação a 282 g durante 10 minutos na TR. O plasma rico em plaquetas e o casaco de buffy foram descartados, mantendo-se a fracção de RBC. O RBC foi contado (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) e ajustado a uma concentração de 5 × 108 células/mL no tampão de tirode (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4)., 109 células foram então diluídas em 45 mL de água duplamente destilada e incubadas durante 5 minutos. A tonicidade do tampão foi então equilibrada por adição de 5 ml de PBS 10X (filtrado através de uma membrana de 0, 22-µm). O RBC remanescente foi removido por centrifugação a 1300 g durante 5 minutos na TR e o sobrenadante foi centrifugado a 18 000 g durante 90 minutos a 18 °C. A cápsula microparticular RBC foi então suspensa em 500 µl de PBS. A concentração de proteínas foi determinada com o doseamento de BCA.,
Western blotting
Mitocondrial tamanho de medição através de espalhamento de luz dinâmico (DLS)
O tamanho do isolado mitocôndrias foi medido por DLS, usando um Zetasizer Nano ZS dispositivo (Malvern instruments, Malvern, EUA) equipado com o padrão de 4 mW, 633 nm He-Ne laser como fonte de luz, definida em um ângulo de detecção de 173°. As experiências foram replicadas três vezes em cuvetas UV descartáveis de 1 cm de comprimento (Brand GMBH, Wertheim, Alemanha) contendo 100 µL de mitocôndrias murinas isoladas diluídas em PBS a uma concentração de 10 µg de proteínas/µL., Os seguintes parâmetros foram levados em conta aquando da medição do tamanho das mitocôndrias: índice de refração do solvente: 1.330, a viscosidade da amostra: 0.8872 mPas, índice de refração das proteínas: 1.45, temperatura: 25 °C.
microscopia eletrônica
Mitocôndria (108) foram corrigidos em 3,5%, a acroleína, por 15 min à temperatura ambiente. As amostras fixas foram enxaguadas duas vezes em PBS e depois incorporadas em agarose a 4%. As secções de 50 µm foram cortadas usando um vibratoma, pós-fixado em 1% de tetroxide de ósmio durante 30 minutos e incorporado na resina de Durcupan., Seções de ultra-nanômetro foram visualizadas a 80 kV usando um Tecnai G2 Spirit BioTWIN (FEI, Hillsboro, ou, USA) microscópio eletrônico de transmissão.
a Avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial
as Mitocôndrias foram em suspensão no mitocondrial ensaio de solução (MAS: 70 mM sacarose, 220 mM de manitol, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM de HEPES, EGTA 1 mM e 0,2%(m/v) de ácido graxo livre de BSA, pH de 7,4 a 37 °C) e suplementado com 10 mM de piruvato, 2 mM malato e 4 µM FCCP , pH 7.4. Um equivalente de 10 µg de proteínas foi semeado em placas XF-96 (Agilent, Santa Clara, CA, EUA)., As placas foram então centrifugadas de 2.000 g durante 20 minutos a 4 °C. visualizamos a distribuição de mitocôndrias sob um microscópio de campo brilhante para garantir a adesão e a repartição homogênea. As placas foram mantidas a 37 ° C sem CO2 durante aproximadamente 40 minutos antes do Carregamento. As taxas de consumo de oxigénio (OCR) foram medidas de acordo com as instruções do fabricante (Biosciência Agilent/Seahorse). Os experimentos foram replicados em três poços e em média para cada condição experimental., De um total de 3 medições de consumo de oxigênio para cada condição foram realizadas aproximadamente a cada 6 minutos, sob basal condições e seqüenciais, além de rotenona (2 µM), succinato (10 mM), antimycin Um (40 µM) e TMPD (N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenodiamina)/Ascorbato (100 µM/10 mM). O succinato foi utilizado como dador de electrões para o complexo II, rotenona como inibidor complexo I, antimicina a como inibidor complexo III e respiração através do complexo IV foi medido utilizando TMPD/ascorbato.,
citometria de fluxo de alta sensibilidade
devido ao seu pequeno tamanho, as mitocôndrias foram detectadas por citometria de fluxo de alta sensibilidade, usando uma “pequena opção de partícula” consistindo de uma dispersão para a frente (FSC) acoplada a um tubo fotomultiplicador (PMT) montado em um produto de pesquisa de ordem especial BD FACS Canto II (SORP, Biociências BD). As mitocôndrias (0,5 µg) foram coradas com 1 µg de anti-TOMM22-Atto 488 (clone do IC9-2, Sigma-Aldrich) e 1 µM de mitotracker vermelho profundo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) por 30 minutos a 37 °C e diluído em PBS, para um volume final de 500 µl antes de citometria de fluxo, análise., Para medir quantitativamente o número de mitocôndrias, usamos microesfera de poliestireno de 3 µm de diâmetro (Polissciências, PA, EUA). 80.000 microesferas foram adicionadas a cada amostra e 500 microesferas foram adquiridas. Partículas de sílica (Kisker Biotech, Steinfurt, Alemanha) foram utilizadas para determinar a escala de tamanho de 100 a 1000 nm.as mitocondrias isoladas foram tratadas a 10 000 g, 4 ° C, 10 min e ressuspendidas em tampão de isolamento a de 0, 8 mL mtDNA para cada 3 mg de proteínas mitocondriais., Mitocôndrias foram então lizadas em um volume (v:v) tampão de isolamento mtDNA B (preparado extemporaneamente. 0, 2 M NaOH, 1% SDS) durante 3 minutos. no gelo, sob agitação suave. as suspensões de mtDNA foram neutralizadas com um volume (v:v) tampão de isolamento mtDNA C (1,32 M acetato de potássio, pH 4,8 ajustado com ácido acético gelado) durante 5 minutos. no gelo, sob agitação suave. Os detritos mitocondriais foram pulverizados por centrifugação durante 10 minutos a 14.000 g, os sobrenadantes foram transferidos para tubos frescos. o mtDNA foi precipitado durante a noite a -20 °C com 0.,1 volume (v:v) acetato de potássio (solução-mãe: 3 M acetato de sódio, pH ajustado para 5.2 com ácido acético gelado) e 0,7 volume (v:v) isopropanol absoluto. a mtDNA foi então granulada a 14 000 g, lavada três vezes com 1, 5 mL de etanol a 70% e ressuspendida em tampão de ressuspensão do ADN (Tris-HCl de 10 mM, EDTA de 10 mM, pH 8, 0). A concentração do ADN mitocondrial foi determinada por espectrofotometria (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).o isolamento dos núcleos dos hepatócitos dos ratinhos foi isolado dos fígados dos ratinhos, utilizando métodos publicados 86., Brevemente, durante os protocolos de isolamento das mitocôndrias, enquanto os sobrenadantes eram utilizados para efectuar isolações mitocôndrias, os pellets das primeiras centrifugações de 700 g foram ressuspendidos em 10 mL de tampão de isolamento de núcleos a frio com gelo (5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 mM de sacarose. pH 7.4) e moído num triturador de tecido de vidro/Teflon pré-arrefecido. A suspensão foi ainda interrompida por três passagens através de uma agulha de calibre 25 G5/8 seguida por duas passagens através de uma agulha de calibre 27 g½., A suspensão foi então filtrada contra um filtro de células de nylon de 40 µM (Thermo Fisher Scientific) e centrifugada a 600 g, 4 °C, 10 min. Os Pellets foram ressuspendidos em 14 mL de tampão a e centrifugados a 600 g, 4 ° C, 10 min. Os Pellets foram então ressuspendidos em 9 volumes de tampão de isolamento de núcleos frios por gelo B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 2, 0 M de sacarose. pH 7.4) e centrifugado a 16,000 g, 4 ° C, 30 min. Os Pellets foram ressuspendidos em 200 µL de PBS e armazenados a -20 °C.,foram extraídos ADN de 25 mg de fígado de rato inteiro ou dos 200 µL ou núcleos isolados, utilizando o Qiamp® DNA Mini Kit (QIAgen), seguindo as instruções do fabricante. As amostras foram eluídas em tampão de ressuspensão do ADN.,
o DNA Mitocondrial e o DNA nuclear enriquecimentos por acordo com pcr
Trinta nanogramas de DNA mitocondrial, o DNA nuclear, ou a mesma quantidade total de DNA extraído a partir de toda mouse fígado utilizando os protocolos acima mencionados, foram amplificados em um Rotor-Gene Q em tempo real de acordo com pcr termociclador (QIAgen), de acordo com protocolos com SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) em 10 µL de volume de reação., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
a digestão mitocondrial do ADN por enzimas de restrição
o mtDNA purificado do rato foi digerido pelas endonucleases de restrição Hae II ou Pst i (NEB, Whitby, ON, Canadá) de acordo com o protocolo do fabricante. Os produtos digeridos (1, 5 µg) foram então resolvidos com um gel de agarose de 0, 5% (M/v). Foram obtidas imagens num sistema de documentação de gel Chemidoc MP (Bio-Rad). O gel de comprimento total é apresentado em Figo suplementar. 6d.,
S1 nuclease tratamento de DNA mitocondrial e nuclear DNA
30 µg de dnamt e nDNA foram diluídos em 200 µL de 1X S1-buffer e tratados com 50 U S1 nuclease (Thermo Fischer Scientific) por 5 minutos a 37 °C. a Reação foi interrompida pela adição de 600 mM de EDTA (concentração final) e incubação a 70 °C por 10 minutos. As amostras foram precipitadas pela adição de acetato de sódio de 300 mM (concentração final) e 2 volumes (v:v) de etanol absoluto durante 16 horas a -20 °C., As amostras foram granuladas a 14 000 g, RT, 20 minutos, lavadas a 1 mL de etanol a 70% e ressuspendidas em tampão de ressuspensão do ADN. Para testes de competição, nDNA e mtDNA não tratados seguiram o mesmo tratamento sem adição da enzima. As amostras foram tratadas pelo qPCR.
Mitocôndrias oxidação in vitro
Dosado mitocôndrias foram peletizadas e em suspensão na concentração de 1,5 mg de proteínas mitocondriais/mL em PBS contendo 500 µM de oxidante tertbutyl hydroperoxide (TBHP) (Sigma-Aldrich)., As mitocôndrias foram oxidadas durante 1 h 30 minutos a 37 ° C sob agitação suave e, em seguida, enxaguadas duas vezes com PBS gelados. Mitocôndrias oxidadas foram posteriormente quantificadas pela BCA.
a formação de substâncias reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS) foi avaliada utilizando o Kit de Parâmetros do TBARS (R &d systems, Minneapolis, MN, USA), seguindo as instruções do fabricante. Duzentos microgramas de mitocôndria foram lisados, as proteínas foram precipitadas usando ácido tricloroacético (TCA) e peletadas a 12.000 g, Temperatura ambiente, 4 minutos., Os sobrenadantes foram transferidos para tubos frescos. Amostras (75 µL) foram incubadas com 37,5 µL de thiobarbituric acid em uma placa de 96 poços para 3 h a 50 °C. Absorbances foram lidos em 532 nm em um SpectraMax 190 leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) e TBARS quantificação foi realizada utilizando uma curva padrão fornecido no kit. As amostras oxidadas foram comparadas com as mitocôndrias de controlo que foram incubadas nas mesmas condições em PBS desprovidas de TBHP.,
oxidação mitocondrial da proteína
a formação de grupos carbonílicos após oxidação mitocondrial in-vitro foi medida utilizando o Kit de ensaio do teor de carbonilo proteico (Sigma Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras oxidadas foram comparadas com as mitocôndrias de controlo que foram incubadas nas mesmas condições em PBS desprovidas de TBHP.,
a Detecção de anticorpos de segmentação mitocondrial epitopos por ELISA
Para a detecção de anti-todo mitocondrial anticorpos ” (“AwMA”), murino mitocôndrias foram diluídos (500 µg/mL) em 50 mM de carbonato/bicarbonato de tampão, pH 9,6 e 25 µL por poço foram carregados de 96 poços meia-limpar área de fundo plano de poliestireno de alto-vinculação de microplacas (Corning, Nova York, EUA). As placas foram revestidas durante 18 h a 4 ° C e depois bloqueadas durante 4 h a 37 °C com PBS contendo 10% de FBS e 0,5% de gelatina. Após três lavagens com PBS, os soros diluíram 1: 150 (salvo indicação em contrário) em PBS-10% FBS-0.,3% de gelatina foram incubadas durante a noite a 4 ° C em duplicado. Após três lavagens com PBS, as placas foram incubadas durante 1 h, à temperatura ambiente, com uma albumina sérica de PBS-0, 4% de bovinos(BSA) conjugada com fosfatase alcalina (AP) ou IgG anti-humana (Sigma-Aldrich) diluída em 1:1000 na albumina sérica de PBS-0, 4%. Placas foram lavadas três vezes com PBS e desenvolvidas com fosfato de P-nitrofenol (p-NPP) por ~30 minutos a 37 °C e densidades ópticas (OD) foram lidas a 405 nm em um leitor de microplacas., O mesmo protocolo foi utilizado para a detecção de auto-anticorpos contra partículas submitocondriais utilizando 25 µL por Poço de SMP diluído (50 µg / mL) em tampão de carbonato/bicarbonato de 50 mM, pH 9, 6. Foi utilizada uma abordagem semelhante para mitocôndrias humanas com a seguinte modificação:as placas foram incubadas com um anticorpo secundário Anti-IgG anti-humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (1: 3.000), a actividade da peroxidase foi revelada à temperatura ambiente durante ~5 minutos com 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB). A reação foi interrompida com 2 N H2SO4 e a ODs foi lida a 450 nm., Para o ELISA anti-mtDNA, as placas foram pré-revestidas com 1% de sulfato de protamina em água duplamente destilada durante 1 h à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com PBS e revestidas durante a noite a 4 °C, com 400 ng mtDNA em PBS. Todos os passos subsequentes foram idênticos aos usados para AwMA-ELISAs. Os valores em branco (antigénios mitocondriais e sem soros) foram substractos a partir dos valores medidos para cada doente. Durante o desenvolvimento destes ensaios, o revestimento adequado dos poços foi testado através da utilização de anticorpos monoclonais do rato, combinados com isótipo (mAb). Um anticorpo monoclonal (Clone IV.,3, 4 µg / mL) foi utilizado em cada instância como controlo negativo do doseamento, enquanto que foram utilizados diferentes anticorpos monoclonais, dependendo dos antigénios do revestimento, como controlo positivo do doseamento: um anti-TOMM22 mAb (Clone IC9-2, 4 µg/mL. Abcam) para mitocôndrias intactas, um mAb anti-ADN (ADN Clone 35I9, 10 µg/mL. Abcam) ou um mAb Anti-citocromo C (Clone 7H8. 2C12, 5 µg / mL. BD Biosciences).,as amostras de soro foram pré-incubadas em tampão de diluição (1: 150) com várias concentrações (0, 25, 1 e 3 mg/mL) de concorrentes (isto é, micropartículas de mitocôndria ou de glóbulos vermelhos) para 3 horas. na TR e incubada em duplicado durante a noite a 4 ° C. Os dados são apresentados como a percentagem de sinal remanescente após cada competição, em comparação com a do (405 nm) medida na ausência de concorrentes.,
foi utilizado um procedimento semelhante para AmtDNA-ELISA, utilizando concentrações aumentadas (0, 3, 9 e 27 ng/µL) de ADN concorrente (extraído de núcleos ou mitocôndrias, com ou sem tratamento de nucleases S1).
Estatísticas
comparações entre grupos foram feitas usando tanto o teste t-test do Estudante, teste Wilcoxon, teste Friedman ou teste Kruskal-Wallis, uma ANOVA de Sentido Único, duas vias ou medidas repetidas ANOVA dependendo do resultado, bem como o número e tipo de grupos., Quando foram avaliadas comparações múltiplas, foram utilizados testes de correcção pós-hoc adequados, tais como Dunn, Dunnett, Sidak ou Bonferroni. as associações entre AwMA, AmtDNA e anti-HSP60 foram calculadas com correlações Spearman. A distribuição destes anticorpos de acordo com os resultados da ACA foi comparada utilizando o teste de Wilcoxon. Associações entre AwMA ou AmtDNA e resultados clínicos foram estudadas por regressões lineares e logísticas bivariadas e multivariadas., Os resultados clínicos estudados são a média íntima de espessura do material, variação percentual do fluxo de dilatação mediada (FMD) da artéria braquial, a presença da febre aftosa, presença de placas na carótida, evento trombótico nunca, as células brancas do sangue, contagem de plaquetas, aumento de DNA ligação por Farr ensaio acima da faixa normal para os testes de laboratório, a presença de danos, de acordo com SLICC Danos Index (SDI > 0), alta atividade de acordo com SLEDAI-2K pontuação da atividade (SLEDAI ≥ 4), presença de nefrite lúpica, biópsia de classe, bem como a cronicidade e o índice de atividade da biópsia., Estes últimos foram ajustados para a duração da doença, idade, Índice de Massa Corporal( IMC), lipoproteínas de baixa densidade (LDL) colesterol, medicação antimalária e prednisona. As regressões logísticas são apresentadas com rácios ímpares e o seu intervalo de confiança Wald de 95%. Os resultados dos participantes foram considerados positivos para AwMA e AmtDNA quando seu valor estava acima do valor-limite identificado após maximizar o Índice de Youden. Foi obtido um intervalo de confiança de 95% para o corte utilizando 10 000 amostras de bootstrap. As medidas de desempenho são apresentadas com o seu intervalo de confiança de 95%.,
o Software
as imagens Western blot foram adquiridas usando os dígitos de estúdio de imagem 5.2 (biotecnologia LI-COR). a migração do mtDNA através do gel de agarose foi fotografada utilizando o Laboratório de Imagem 6, 0, 1 (Bio-Rad). Estudos DLS foram realizados usando o software Zetasizer 7.10 (Malvern Instruments). Em images were acquired with the Image Capture Software 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). A citometria de fluxo foi realizada utilizando a BD FACSDiva™ 6.1.3 (Biociências BD). Os rendimentos das isolações de ADN foram quantificados utilizando o ND-1000 3.8.,1 software (Thermo Fisher Scientific) e qPCR foram realizados com RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). As densidades ópticas foram medidas usando SoftMax Pro 5.4.1 (dispositivos moleculares). As figuras foram montadas com ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) e Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA). Análises estatísticas foram realizadas com Prism 7 software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) e SAS version 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).