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discussão
é importante relacionar as variações genéticas com os fenótipos clínicos utilizando ferramentas de fenotipagem adequadas da actividade do CYP3A4. A 3-hidroxilação da quinina tinha sido provada como uma reacção biomarcadora para a actividade da CYP3A4 porque a 3-hidroxilação da quinina é catalizada pela CYP3A4 tanto in vivo como in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Assim, os parâmetros cinéticos da catálise enzimática na 3-hidroxilação da quinina foram utilizados como medida da actividade do CYP3A4 no presente estudo.
vinte e três das holoenzimas do CYP3A4 recombinante mostraram uma diminuição significativa do CLint para o quinino. Seis variantes, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift), e CYP3A4*21 (Y319C), expôs muito menor CLint para a quinina (1.44–5.80%, Tabela 2) que tipo selvagem CYP3A4*1A., Se o nosso in vitro resultados são replicados em estudos clínicos, os pacientes que são portadores esses alelos podem ser potencialmente CYP3A4 pobres-metabolizers e poderá: i) necessitam de menores doses de quinino para alcançar concentrações plasmáticas terapêuticas; e ii) estar em maior risco de efeitos adversos e toxicidade convencionais, quando as doses de quinino são utilizados.
CYP3A4*2 (S222P) exibiu um CLint reduzido de mais de seis vezes (14, 76%, Tabela 2) para o quinino, em comparação com o tipo selvagem CYP3A4*1A., Esta diminuição da atividade enzimática pode ser porque uma serina→substituição prolina de aminoácidos pode causar uma grande mudança na estrutura tridimensional da enzima (prolina é conhecida por quebrar hélices Alfa). Da mesma forma, o CYP3A4*2 possui um CLint inferior para o midazolam (Miyazaki et al., 2008), nifedipine (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018), e lidocaína (Fang et al., 2017), do que a enzima de tipo selvagem. Em contraste, o CYP3A4*2 mostrou um CLint mais elevado para a amiodarona (Yang et al., 2019)., Para a testosterona, a CYP3A4 * 2 apresentou uma depuração intrínseca diminuída quando expressa utilizando o sistema Expresso de Escherichia coli in vitro (Miyazaki et al., 2008), mas a actividade foi comparável à enzima de tipo selvagem quando expressa no sistema de expressão do baculovírus (Sata et al., 2000) (Quadro 3).
CYP3A4*3 (M445T) apresentaram menor actividade enzimática para a quinina, em comparação com o alelo de tipo selvagem (Quadro 2)., O resíduo de aminoácidos 445 está localizado na região conservada de ligação heme, apenas dois terminais de aminoácidos C para o Cys absolutamente conservado na posição 442 na proteína CYP3A4 (Sata et al., 2000); conseqüentemente, uma mudança Met445Thr pode exercer um efeito desfavorável sobre a ligação heme, resultando em uma alteração na atividade catalítica da enzima, especialmente quando se liga um substrato adequado. Mas, como indicado na Tabela 3, a actividade enzimática do CYP3A4*3 foi semelhante à do CYP3A4 de tipo selvagem para a maioria dos substratos testados., A discrepância de resultados pode surgir de diferentes métodos de expressão heteróloga usados, e devido à diferente especificidade de substrato para a variante.os estudos de mutagénese no local sugerem que o ser119 é um aminoácido principal implicado como resíduo no local activo (Yano et al., 2004). Assim, é provável que a mutação Ile118Val afete a conformação do local ativo, resultando em diminuição da atividade catalítica., Do mesmo modo, um estudo in vivo demonstrou que a razão entre o nível urinário de 6β-hidroxicortisol/cortisol livre nestes indivíduos heterozigóticos era inferior à dos controlos saudáveis, sugerindo uma diminuição das actividades enzimáticas (Hsieh et al., 2001).tanto as variantes CYP3A4*8 e *13 apresentaram níveis detectáveis, embora inferiores, de holoproteínas CYP3A4 e tiveram actividades catalíticas extremamente baixas em relação ao quinino. Contrariamente aos nossos resultados, CYP3A4*8 e *13 não apresentaram holoproteínas CYP detectáveis quando expressas em sistemas bacterianos (Eiselt et al., 2001)., Nós especulamos que o uso de sistemas de expressão bacteriana vs. inseto pode explicar os diferentes resultados. O sistema de expressão bacteriana carece de um ambiente de membrana intracelular (Gonzalez e Korzekwa, 1995) necessário para a alta expressão de proteínas. Em contraste, as células de insetos podem processar e modificar proteínas de uma forma semelhante às células humanas, permitindo a dobragem adequada da enzima e a incorporação do cofator heme, resultando em maior expressão das proteínas CYP3A4.,
CYP3A4*11 (T363M) foi expresso em níveis significativamente mais baixos do que o CYP3A4 de tipo selvagem (Figura 2), um resultado consistente com estudos utilizando sistemas de expressão bacteriana ou de mamíferos (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). A treonina no resíduo 363 no local de reconhecimento do substrato (SRS)-5 pode contribuir para a formação da rede de ligação do hidrogénio. Uma substituição de treonina para metionina pode resultar na perda de atividade catalítica (Murayama et al., 2002). O CYP3A4 * 11 apresentou uma actividade reduzida de hidroxilação da quinina no estudo actual., Adicionalmente, o CYP3A4 * 11 mostrou uma actividade reduzida de hidroxilação da testosterona (Murayama et al., 2002), tinha aumentado notavelmente o CLint para lidocaína (Fang et al., 2017) e amiodarona (Yang et al., 2019), mas não foi associada a alterações perceptíveis nas atividades metabólicas do ibrutinib (Xu et al., 2018) (Quadro 3).
CYP3A4 * 12 (L373F) apresentaram uma redução drástica do CLint para a quinina, da mesma forma que um resultado de investigação anterior para o midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4 * 12 possui uma mudança de aminoácido de Leu373Phe; o resíduo mutante está localizado perto de Arg-372 e Glu-374, que participam na formação de uma rede de ligação de hidrogénio e estão envolvidos em locais ativos de acordo com estudos envolvendo mutagénese dirigida ao local (Yano et al., 2004). Assim, é provável que o resíduo mutacional (L373F) afecte a estabilidade da rede de ligação ao hidrogénio e a conformação espacial da cavidade do local activo, resultando numa actividade catalítica alterada do CYP3A4*12.,
CYP3A4 * 20 (488 frameshift) mostrou uma expressão de apoproteína notavelmente diminuída (Figura 1) e reduziu drasticamente a CLint para a quinina. Em contrapartida, não foram notificadas actividades catalíticas de midazolam 1 ‘ -e 4-hidroxilação em microssomas de levedura ou HEK 293 que expressem CYP3A4*20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Estes resultados conflitantes podem ser atribuíveis aos diferentes sistemas de expressão heteróloga e substratos usados nos experimentos. Além disso, uma heterozigota CYP3A4*20, Identificada em indivíduos brasileiros, tem sido relatada como apresentando uma depuração sistémica reduzida de ∼1.,9 vezes para midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Foi colocada a hipótese de que esta mutação rara poderia influenciar a dobragem de proteínas, a incorporação de heme (Westlind-Johnsson et al., 2006), e a conformação espacial da cavidade do sítio ativo, dando origem a uma diminuição ou perda da atividade catalítica associada ao substrato utilizado.
CYP3A4 * 21 (Y319C), que foi identificado na população chinesa (Zhou et al., 2011), mostrou fraca atividade catalítica para o quinino em nosso estudo. Curiosamente, não foi identificada nenhuma expressão detectável de apoenzima nos nossos resultados., Tyr319 é um resíduo altamente conservado na família do citocromo P450 ao longo da evolução de eukaryote do nemátodo ao humano (Zhou et al., 2011). De acordo com as previsões funcionais in silico (Zhou et al., 2011), Tyr319 residue lies on an important domain and a substitution of Tyr with Cys at position 319 of the CYP3A4*21 protein may induce dramatic alterations in active-site cavity configuration. Assim, o CYP3A4 * 21 Pode produzir uma proteína defeituosa com actividade catalítica reduzida em relação ao quinino., Adicionalmente, especulou-se que estes anticorpos que usámos para detectar as apoproteínas recombinantes CYP3A4 podem não ser adequados para detectar a variante CYP3A4*21. Ou seja, a mutação de Tyr319Cys no CYP3A4*21 pode impedir que estes anticorpos reconheçam os epitópios específicos no CYP3A4.
em contraste, duas das holoenzimas CYP3A4 recombinantes, CYP3A4*15 (R162Q) e CYP3A4*29 (F113I), apresentaram um aumento significativo do CLint para a quinina. Da mesma forma, tanto o CYP3A4*15 como o CYP3A4*29 apresentaram um aumento do CLint para lidocaína (Fang et al., 2017), mas mostrou diminuição de CLint para ibrutinib (Xu et al., 2018)., CYP3A4 * 15 foi detectado primeiro em diferentes populações étnicas com pequenas amostras para cada grupo étnico (Lamba et al., 2002). O CYP3A4 * 29 foi identificado e nomeado no nosso estudo recente (Hu et al., 2017). As duas variantes estão relacionadas com o metabolismo rápido do quinino in vitro. Se for encontrada confirmação de um aumento da depuração da quinina em indivíduos que são portadores homozigóticos ou heterozigóticos do CYP3A4*29 ou CYP3A4*15, estes indivíduos podem ser metabolizadores ultra-rápidos do CYP3A4 da quinina., Os doentes com estes genotipos podem: i) ter menor eficácia terapêutica quando são administradas doses clínicas habituais de quinina; e ii) necessitar de doses mais elevadas para atingir concentrações plasmáticas terapêuticas.
não foram detectadas holoenzimas activas do CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop) e CYP3A4*30 (R130Stop) variantes e, consequentemente, não apresentaram actividade metabólica sobre o quinino (Tabela 2).,
CYP3A4 * 6 tem uma inserção de um resíduo de adenina no exon 9 (830-831 insA); esta mutação causa um deslocamento de Frames e leva à tradução de uma proteína truncada que não pode incorporar heme (Hsieh et al., 2001). Consequentemente, a actividade catalítica do CYP3A4*6 para o quinino não foi identificada no nosso estudo. Tal como demonstrado anteriormente in vivo, verificou-se que uma pessoa chinesa era heterozigótica para o CYP3A4*6 com uma relação muito mais baixa do nível urinário de 6β-hidroxicortisol:cortisol livre do que indivíduos de tipo selvagem, sugerindo uma diminuição da actividade do CYP3A4 (Hsieh et al., 2001)., Do mesmo modo, um doente heterozigótico para a CYP3A4*6, submetido a transplante de órgãos, teve uma razão de concentração para ajuste da dose de tacrolimus 4, 3 vezes mais elevada do que a de doentes de tipo selvagem (Jun et al., 2009).
CYP3A4*26 tem uma substituição nucleótida C→T em exon 5. Isto causa uma mudança da arginina para um codon de paragem prematura na posição 268, e resulta em uma proteína putativa encurtada sem domínio catalítico e, portanto, atividade (Werk et al., 2014)., A CYP3A4 * 26 pode não ser expressa devido à paragem prematura do codão na posição 268 ou, se for, a proteína pode ser marcada para uma degradação rápida (Werk et al., 2014). Consequentemente, não conseguimos detectar a holoproteína da variante CYP3A4 * 26 expressa em células Sf21. Da mesma forma, um doente com 19 anos de idade transplantado para os rins, identificado como um homozigoto para o CYP3A4*26 e, entretanto, também um homozigoto para o CYP3A5*3, exibiu um nível plasmático inesperadamente elevado de tacrolimus como resultado de uma depuração extremamente diminuída de tacrolimus (Werk et al., 2014).,
semelhante ao CYP3A4*26, CYP3A4 * 30 tem uma mudança de arginina para um codão de paragem prematura na posição 130 (Hu e al., 2017). O Arg130 é considerado importante para a incorporação de heme (Eiselt et al., 2001) e, assim, a mutação do Arg130 interromperia a incorporação de heme e afectaria assim a expressão de holoenzima do CYP3A4.em combinação com estudos anteriores (Quadro 3), algumas variantes alélicas do CYP3A4 mostraram as diferentes preferências para os substratos, ao contrário das enzimas do tipo selvagem. Nomeadamente, algumas variantes apresentam actividades catalíticas alteradas com um perfil dependente do substrato., Tal como acima referido, os resultados conflitantes decorrentes de um substrato específico em estudos podem surgir de muitos factores, tais como discrepâncias do método in vitro ou in vivo e diferentes sistemas de expressão heteróloga.a quinina tem efeitos adversos frequentes, devido ao seu estreito índice terapêutico (Bateman e Dyson, 1986). Estas reacções adversas não foram apenas induzidas por fármacos; foram também causadas por bebidas comuns contendo quinino., Com base numa revisão sistemática dos dados clínicos de cento e catorze Artigos, as reacções adversas resultantes de bebidas contendo quinino representaram 20% do total das reacções adversas ao quinino (Liles et al., 2016). Surpreendentemente, mesmo com uma exposição mínima de bebidas comuns, alguns indivíduos experimentaram reacções adversas graves envolvendo vários sistemas de órgãos. Dada a óbvia diversidade inter-individual na sensibilidade ao quinino, a variação no CYP3A4 pode ser um mecanismo possível subjacente aos efeitos sensíveis ao quinino e aos efeitos adversos., Além disso, os regulamentos para quinine uso não foram estabelecidas em alguns países, tais como, comprimidos contendo 50 mg ou menos de quinino são consideradas como um produto natural e estão disponíveis sem receita médica no Canadá (Liles et al., 2016); loções e champôs contendo quinino, bem como bebidas contendo quinino, permanecem comumente disponíveis e a supervisão não é necessária. Assim, considera-se necessário aumentar a sensibilização dos médicos e do público para as diferenças interindividuais na sensibilidade ao quinino e para as reacções adversas ao quinino.