Anti-mitocondriali autoanticorpi în lupusul eritematos sistemic și asocierea lor cu manifestări de boală
de aprobare Studiu
populație de pacienți
uman seruri testate în acest studiu au fost obținute de la o Universitate de Sănătate Rețea de cercetare consiliul de etică (REB) aprobat studiul de LES și APS pacienții din Toronto, precum și la subiecții sănătoși și pacienții CBP recrutat CHU de Québec – Université Laval REB studii aprobate în Quebec City., Pacienții cu LES au trebuit să îndeplinească criteriile de clasificare ACR din 1982 pentru Les revizuite în 199781,82, iar pacienții cu APS au îndeplinit criteriile Sapporo din 1999 pentru APS revizuite în 200683,84. Pentru LES, consecutive pacienții de sex feminin de la Universitatea din Toronto Lupus Clinica (UTLC) au fost abordate și cu condiția acordul între August 2010 și octombrie 2011, pentru a fi parte a unui studiu cu privire la rolul acizilor grași și a bolilor cardiovasculare în lupus. Ei au furnizat o probă de sânge și au datele clinice anonimizate legate de biospecimenul lor., În mod similar, pacienții APS văzuți la Clinica de Reumatologie din Toronto au fost abordați după o procedură similară. Toate biospecimenele rămase ar putea fi utilizate pentru studii viitoare privind biomarkerii lupusului, conform consimțământului subiecților originali. Voluntarii sănătoși de control au fost recrutați ca parte a studiului privind markerii inflamației dacă nu aveau boli cunoscute și nu aveau simptome infecțioase la momentul extragerii sângelui. Vârsta și sexul au fost colectate la acel moment. Pacienții cu PBC au îndeplinit criteriile de clasificare PBC din 2009, revizuite în 201838,85, inclusiv pozitivitatea anticorpilor anti-mitocondriali.,
datele din laboratoarele clinice
pentru pacienții cu LES, anti-dsDNA au fost măsurate utilizând testul Farr (limită de laborator de 30%), iar anti-cardiolipina (limite de laborator IgG și IgM de 40 de unități GPL sau MPL) au fost măsurate prin ELISA într-un laborator clinic.
cultura celulară
modelul inductibil de șoarece al les
recomandările Consiliului Canadian pentru îngrijirea animalelor au fost urmate într-un protocol aprobat de Comitetul pentru bunăstarea animalelor de la Université Laval., C57BL / 6 J au fost obținute de la Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, SUA) și adăpostite într-o instalație de animale de elită, plus specifică, fără agenți patogeni, la CHU de Quebec. Autoanticorpii SLE au fost induși la acești șoareci, așa cum s-a descris anterior63. Pe scurt, 6-8 săptămâni bărbat în vârstă de soareci au primit 100 µL eu.v. injecții de ß2GPI (20 µg) (Cristal de Chimie, Downers Grove, IL, statele UNITE ale americii), urmat 24 de ore mai târziu de o 100 µL eu.v. injecție de lipopolysaccharide (LPS de E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, st. Louis, MO, statele UNITE ale americii)., Aceste injecții au fost repetate după 2 și 4 săptămâni pentru un total de trei runde de imunizări și șoareci au fost sângerate 48 h după a treia imunizare. Șoarecii c57bl / 6 J injectați i.v. cu PBS conform aceleiași scheme au fost utilizați ca controale.
etică
pe parcursul întregului studiu, probele de sânge au fost obținute de la pacienți cu consimțământ informat. Toate metodele prezentate în acest studiu au fost efectuate în conformitate cu orientările și reglementările relevante atât pentru donatorii umani, cât și pentru cei murini.,
Mitocondriile izolare
Mitocondriile au fost izolată din ficat de C57BL/6 J șoareci după o combinație a publicat protocols61,62. Șoarecii au fost sacrificați prin dislocarea cervicală, ficatul a fost îndepărtat rapid, vezica biliară excizată și ficatul a fost clătit în PBS rece cu gheață (137 mM NaCl, 3 mM KCL, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Ficatul a fost apoi tocat și transferat într-o râșniță de țesut din sticlă/teflon pre-răcită, conținând 12 mL tampon de izolare mitocondrială rece cu gheață (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM zaharoză) pe gram de ficat, apoi măcinat până la obținerea unei suspensii omogene. Celulele și nucleele intacte au fost granulate de două ori la 700 g, 4 °C, 10 min. Membranele contaminante, proteinele și organelele au fost eliminate prin două centrifugări la 7,000 g, 4 °C, 10 min, urmată de o centrifugare la 10,000 g, 4 °C, 10 min., Brut mitocondriale suspendarea a fost purificat în continuare prin ultracentrifugare împotriva unui gradient Percoll (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v:v Percoll) la 95.000 de g, 4 °C, 30 min. Banda care conține mitocondrii a fost colectată în PBS. O abordare similară a fost utilizată pentru a izola mitocondriile umane, cu excepția faptului că până la 107 celule Hep-G2 au fost lizate prin pasaje repetate printr-un ac cu ecartament îngust., Kitul comercial QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Germania) a fost de asemenea utilizat, urmând instrucțiunile producătorului, pentru a izola mitocondriile de celulele Hep-G2 pentru compararea calității prin western blotting cu protocolul menționat mai sus. Mitocondriile izolate au fost dozate prin metoda acidului bicinchoninic (BCA) folosind kitul de testare a proteinelor BCA (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, SUA). Mitocondriile proaspăt izolate au fost utilizate în toate experimentele, cu excepția preparatelor de particule submitocondriale pentru care mitocondriile granulate au fost păstrate la -80 °C până la nevoie.,
particule Submitocondriale (SMP) preparat
SMP au fost preparate așa cum s-a descris în altul60. Pe scurt, mitocondriile înghețate au fost dezghețate la temperatura camerei și diluate la 10 mg de proteine mitocondriale în acid 4-Morfolinepropansulfonic (Mops) de 10 mM. Probele au fost apoi sonicate folosind un Dismembrator Fisher Sonic Model 500 (Thermo Scientific) la o putere maximă de 20% Timp de 20 de secunde, apoi păstrate pe o baie de apă cu gheață sărată timp de 10 minute. Acest ciclu a fost repetat de nouă ori., Probele au fost apoi centrifugate la 16.000 g, 4 °C, 10 minute pentru a elimina mitocondriile neîntrerupte și alte resturi nedorite. Supernatanții au fost colectați într-un tub proaspăt și volumele lor ajustate la 2 mL în mopuri de 10 mM. Probele au fost apoi ultracentrifugate la 150.000 g, 4 °C timp de 45 de minute. SMP granulate au fost resuspendate în tampon SMP (225 mM manitol, 75 mM zaharoză, 10 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7,4) și dozate. Preparatele PSP au fost păstrate la -80 °C până la nevoie.,
celule Roșii din sânge microparticule (RBCMP) pregătirea
celule Rosii din sange (RBC) au fost izolate din sângele uman sănătos voluntari prin centrifugare la 282 g pentru 10 minute la RT. Plasmă bogată în trombocite și trombocitar au fost aruncate, iar RBC fracțiune păstrat. RBC au fost numărate (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, statele UNITE ale americii) și ajustat la o concentrație de 5 × 108 celule/mL în Tyrode tampon (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucoză, 10 mM HEPES, pH 7.4)., 109 celule au fost apoi diluate în 45 mL apă dublu distilată și incubate timp de 5 minute. Tonicitatea tamponului a fost apoi echilibrată prin adăugarea a 5 ml de PBS 10X (filtrată printr-o membrană de 0,22 µm). Resturile de RBC au fost îndepărtate prin centrifugare la 1,300 g timp de 5 minute la RT și supernatantul a fost centrifugat la 18,000 g timp de 90 minute la 18 °C. peleta de microparticule RBC a fost apoi suspendată în 500 µl PBS. Concentrația proteinei a fost măsurată prin testul BCA.,măsurarea mărimii mitocondriale prin împrăștierea dinamică a luminii (DLS)
dimensiunea mitocondriilor izolate a fost măsurată prin DLS, folosind un dispozitiv Zetasizer Nano ZS (Malvern instruments, Malvern, UK) echipat cu laserul He-Ne standard de 4 MW, 633 nm ca sursă de lumină, setat la un unghi de detecție de 173°. Experimentele au fost replicate de trei ori în cuve UV de unică folosință de 1 cm lungime (Brand GMBH, Wertheim, Germania) conținând 100 µL de mitocondrii murine izolate diluate în PBS la o concentrație de 10 µg proteine/µL., Următorii parametri au fost luate în considerare la măsurarea dimensiunii mitocondriale: indicele de refracție al solvent: 1.330 de viscozitate, de exemplu: 0.8872 mPas, indicele de refracție de proteine: 1.45, temperatura: 25 °C.
microscopie electronică
Mitocondrii (108) au fost stabilite în 3,5% acroleina pentru 15 min la temperatura camerei. Probele fixe au fost clătite de două ori în PBS, apoi încorporate în agaroză 4%. Secțiunile de 50 µm au fost tăiate folosind un vibratom, post-fixate în tetroxidă de osmiu 1% timp de 30 de minute și încorporate în rășină Durcupan., Secțiunile ultrathin de șaptezeci de nanometri au fost vizualizate la 80 kV folosind un microscop electronic de transmisie Tecnai G2 Spirit BioTWIN (Fei, Hillsboro sau, SUA).evaluarea consumului de oxigen mitocondrial mitocondriile au fost resuspendate în soluția de testare mitocondrială (MAS: 70 mM zaharoză, 220 mM manitol, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mm EGTA și 0,2% (g/v) BSA fără acizi grași, pH 7,4 la 37 °C) și suplimentate cu 10 mM piruvat, 2 mM malat și 4 µM FCCP, pH 7,4. Un echivalent de 10 µg proteine a fost însămânțat pe plăcile XF-96 (Agilent, Santa Clara, CA, SUA)., Plăcile au fost apoi centrifugate 2.000 g timp de 20 min la 4 °C. am vizualizat distribuția mitocondriilor sub un microscop cu câmp luminos pentru a asigura aderența și repartiția omogenă. Plăcile au fost menținute la 37 °C fără CO2 timp de aproximativ 40 de minute înainte de încărcare. Ratele de consum de oxigen (OCR) au fost măsurate în conformitate cu instrucțiunile producătorului (Agilent/Seahorse Bioscience). Experimentele au fost replicate în trei puțuri și medii pentru fiecare condiție experimentală., Un total de 3 măsurători ale consumului de oxigen pentru fiecare condiție s-au făcut aproximativ la fiecare 6 minute în condiții bazale și după secvențială plus de rotenon (2 µM), succinat (10 mM), antimycin O (40 µM) și TMPD (N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiamina)/Ascorbat (100 µM/10 mM). Succinat a fost folosit ca donator de electroni pentru complex II, rotenone ca un complex am inhibitor, antimycin O ca un complex III inhibitor și respirația prin complexul IV a fost măsurată folosind TMPD/ascorbat.,datorită dimensiunilor mici, mitocondriile au fost detectate prin citometrie în flux de înaltă sensibilitate, folosind o „opțiune de particule mici” constând dintr-o dispersie înainte (FSC) cuplată la un tub fotomultiplicator (PMT) montat pe un produs de cercetare de comandă specială BD FACS Canto II (SORP, BD Biosciences). Mitocondriile (0,5 µg) au fost colorate cu 1 µg de anti-TOMM22-Atto 488 (clona IC9-2, Sigma-Aldrich) și 1 µM de mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, statele UNITE ale americii) pentru 30 de minute la 37 °C și se diluează cu PBS la un volum final de 500 µl înainte de citometrie în flux de analiză., Pentru a măsura cantitativ numărul mitocondriilor, am folosit microsferă de polistiren cu diametrul de 3 µm (Polysciences, PA, SUA). La fiecare probă s-au adăugat 80.000 de microsfere și s-au achiziționat 500 de microsfere. Particulele de silice (Kisker Biotech, Steinfurt, Germania) au fost utilizate pentru a determina scara de dimensiuni de 100-1000 nm.
extracția ADN-ului mitocondrial prin liză alcalină
mitocondriile izolate au fost granulate la 10,000 g, 4 °C, 10 min și resuspendate în 0,8 mL tampon de izolare mtDNA A pentru fiecare 3 mg de proteine mitocondriale., Mitocondriile au fost apoi lyzed într-un volum (v:v) tampon de izolare mtDNA B (extemporaneously-preparat. 0,2 m NaOH, 1% SDS) timp de 3 min. pe gheață, sub agitație blândă. suspensiile mtDNA au fost neutralizate cu un tampon de izolare mtDNA de volum (v:v) c (acetat de potasiu 1,32 m, ph 4,8 ajustat cu acid acetic rece ca gheața) timp de 5 min. pe gheață, sub agitație blândă. Resturile mitocondriale au fost granulate prin centrifugare timp de 10 minute la 14.000 G, RT. Supernatanții au fost transferați în tuburi proaspete. mtDNA a fost precipitat peste noapte la -20 °C cu 0.,1 volum (v: v) acetat de potasiu (soluție stoc:3 m acetat de sodiu, pH ajustat la 5,2 cu acid acetic rece ca gheața) și 0,7 volum (v: v) izopropanol absolut. mtDNA a fost apoi granulat la 14,000 g, spălat de trei ori cu 1,5 mL etanol 70% și resuspendat în tampon de resuspendare a ADN-ului (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). Concentrația ADN-ului mitocondrial a fost determinată prin spectrofotometrie (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
izolarea nucleelor din hepatocitele de șoarece
nucleii au fost izolați din ficatul de șoarece utilizând metode publicate86., Pe scurt, în timpul mitocondriile izolare, în timp ce supernatantele au fost folosite pentru efectuarea de mitocondrii izolații, pelete din prima 700 g centrifugare au fost resuspendate în 10 mL de gheață-rece nuclee izolare tampon A (5 mM MgCl2, 10 mM Tris–HCl, 250 mM Zaharoză. pH 7.4) și măcinate într-o sticlă pre-răcită/râșniță de țesut Teflon. Suspensia a fost întreruptă în continuare de trei treceri printr-un ac de calibru 25 G5/8, urmat de două treceri printr-un ac de calibru 27 g½., Suspensia a fost apoi filtrată pe un filtru de celule din nylon de 40 µM (Thermo Fisher Scientific) și centrifugată la 600 g, 4 °C, 10 min. Peletele au fost resuspendate în 14 mL tampon A și centrifugate la 600 g, 4 °C, 10 min. Peletele au fost apoi resuspendate în 9 volume de tampon de izolare a nucleelor reci de gheață B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris– HCl, 2,0 m zaharoză. pH 7,4) și centrifugat la 16.000 g, 4 °C, 30 min. Peletele au fost resuspendate în 200 µL PBS și depozitate la -20 °C.,
izolarea ADN-ului celular și nuclear
ADN-ul fie din 25 mg de ficat întreg de șoarece, fie din nucleele 200 µL sau izolate au fost extrase folosind QIAmp® ADN Mini Kit (QIAgen), urmând instrucțiunile producătorului. Probele au fost eluate în tamponul de resuspendare a ADN-ului.,
ADN-ul Mitocondrial și ADN-ul nuclear enrichments prin qPCR
Treizeci de nanograme de ADN-ul mitocondrial, ADN-ul nuclear sau aceeași cantitate de ADN-ul total extras din ficat de șoarece folosind protocoalele menționate mai sus, s-au amplificat într-un Rotor-Gene Q real time qPCR cycler (QIAgen) în conformitate cu protocoalele standard cu SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) în 10 µL de reacție volum., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,digestia ADN-ului mitocondrial prin enzime de restricție mtDNA purificată de șoarece a fost digerată de endonucleazele de restricție Hae II sau Pst I (NEB, Whitby, ON, Canada) în conformitate cu protocolul producătorului. Produsele digerate (1, 5 µg) au fost apoi rezolvate cu un gel de agaroză 0, 5% (g/v). Imaginile au fost achiziționate pe un sistem de documentare Gel Chemidoc MP (Bio-Rad). Gelul de lungime completă este prezentat în Fig suplimentar. 6d.,
S1 nuclează tratament de ADN mitocondrial și ADN-ul nuclear
30 µg de adn mitocondrial și nDNA au fost diluat în 200 µL de 1X S1-tampon și tratate cu 50 U S1 nuclează (Thermo Fischer Științifice) pentru 5 minute la 37 °C. Reacția a fost oprită prin adăugare de 600 mM EDTA (concentrația finală) și incubare la 70 °C timp de 10 minute. Probele au fost precipitate prin adăugarea a 300 mM acetat de sodiu (concentrație finală) și 2 volume (v:v) etanol absolut timp de 16 ore la -20 °C., Probele au fost granulate la 14,000 G, RT, 20 minute și spălate 1 mL etanol 70% și resuspendate în tampon de resuspendare a ADN-ului. Pentru testele de concurență, nDNA și mtDNA netratate au urmat același tratament fără adăugarea enzimei. Probele au fost dozate de qPCR.
Mitocondriile oxidare in-vitro
Dozat mitocondriile au fost granulat și suspensia va fi omogenizată, la o concentrație de 1,5 mg de proteine mitocondriale/mL în PBS conținând 500 µM de oxidant tertbutyl de cumen (TBHP) (Sigma-Aldrich)., Mitocondriile au fost oxidate timp de 1 h 30 min la 37 °C sub agitare blândă, apoi clătite de două ori cu PBS rece ca gheața. Mitocondriile oxidate au fost ulterior cuantificate de BCA.
Mitocondriale oxidarea lipidelor
acid Tiobarbituric substanțele reactive (TBARS) formarea fost evaluate, folosind TBARS Parametru Kit (R&D sisteme, Minneapolis, MN, statele UNITE ale americii), urmând instrucțiunile producătorului. Două sute de micrograme de mitocondrii au fost lizate, proteinele au fost precipitate folosind acid tricloroacetic (TCA) și granulate la 12.000 g, temperatura camerei, 4 min., Supernatanții au fost transferați în tuburi proaspete. Probe (75 ml) au fost incubate cu 37.5 µL de acid tiobarbituric într-un 96-ei bine placa timp de 3 h la 50 °C. absorbanța soluției au fost citite la 532 nm pe o SpectraMax 190 cititor de microplăci (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, statele UNITE ale americii) și TBARS cuantificarea s-a efectuat folosind o curbă standard furnizat în kit. Probele oxidate au fost comparate cu mitocondriile de control care au fost incubate în aceleași condiții în PBS lipsite de TBHP.,
oxidarea proteinelor mitocondriale
formarea fragmentelor de carbonil în urma oxidării mitocondriale in vitro a fost măsurată folosind kitul de testare a conținutului de carbonil al proteinei (Sigma Aldrich) urmând instrucțiunile producătorului. Probele oxidate au fost comparate cu mitocondriile de control care au fost incubate în aceleași condiții în PBS lipsite de TBHP.,
Detectarea anticorpilor vizează mitocondriale epitopi prin ELISA
Pentru detectarea anti-tot mitocondriale anticorpi (AwMA), murin mitocondriile au fost diluat (500 µg/mL) în 50 mM tampon carbonat-bicarbonat, pH de 9,6 și 25 µL pe godeu fost încărcate într-96-ei bine, jumătate din zona de clar fund plat polistiren de înaltă obligatoriu microplăci (Corning, New York, statele UNITE ale americii). Plăcile au fost acoperite timp de 18 ore la 4 °C, apoi blocate timp de 4 ore la 37 °C cu PBS conținând 10% FBS și 0,5% gelatină. După trei spălări cu PBS, serurile diluate 1:150 (dacă nu se specifică altfel) în PBS-10% FBS-0.,3% gelatină au fost incubate peste noapte la 4 °C în dublu exemplar. După trei spălări cu PBS, plăcile au fost incubate timp de 1 h la temperatura camerei cu fosfatază alcalină-(AP) conjugată capră anti-șoarece sau IgG anti-uman (Sigma-Aldrich) diluat 1:1,000 în PBS-0,4% albumină serică bovină (BSA). Plăcile au fost spălate de trei ori cu PBS și dezvoltate cu fosfat de p-nitrofenol (p-NPP) timp de ~30 min la 37 °C și densitățile optice (OD) au fost citite la 405 nm pe un cititor de microplăci., Același protocol a fost utilizat pentru detectarea autoanticorpilor care vizează particulele submitocondriale utilizând 25 µL pe godeu de SMP diluat (50 µg/mL) în tampon carbonat/bicarbonat de 50 mM, pH 9.6. O abordare similară a fost utilizată pentru mitocondriile umane cu următoarea modificare:plăcile au fost incubate cu un anticorp secundar IgG conjugat cu peroxidază de hrean (1: 3000), activitatea peroxidazei a fost dezvăluită la temperatura camerei timp de ~5 min cu 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidină (TMB). Reacția a fost oprită cu 2 N H2SO4, iar ODs-ul a fost citit la 450 nm., Pentru Elisa anti-mtDNA, plăcile au fost pre-acoperite cu sulfat de protamină 1% în apă dublu distilată timp de 1 h la temperatura camerei. Plăcile au fost spălate de trei ori cu PBS și acoperite peste noapte la 4 °C cu 400 ng mtDNA în PBS. Toate etapele ulterioare au fost identice cu cele utilizate pentru AwMA-ELISAs. Valorile martor (antigene mitocondriale și Niciun ser) au fost scăzute din valorile măsurate pentru fiecare pacient. În timpul dezvoltării acestor teste, acoperirea corespunzătoare a puțurilor a fost testată prin utilizarea anticorpilor monoclonali de șoarece potriviți cu izotip (mAb). Un anticorp monoclonal (clona IV.,3, 4 µg/mL) a fost folosit ca un test negativ control în fiecare instanță, în timp ce diferite anticorpi monoclonali au fost folosite, în funcție de acoperire antigene, ca pozitiv test de control: un anti-TOMM22 mAb (Clona IC9-2, 4 µg/mL. Abcam) pentru mitocondriile intacte, un MAB anti-ADN (clonă 35I9 ADN, 10 µg/mL. Abcam) sau un anti-citocrom C mAb (clonă 7H8.2c12, 5 µg/mL. BD Biosciences).,
Concurenței test
AwMA-ELISAs au fost efectuate după cum este descris în secțiunile anterioare, cu următoarele modificări: probele de ser au fost pre-incubate în tampon (1:150) adiționat cu diferite concentrații (0.25, 1 și 3 mg/mL) de concurenți (de exemplu, mitocondrii sau celule rosii din sange microparticule) timp de 3 ore. la RT și incubat în duplicat peste noapte la 4 °C. datele sunt prezentate ca procent de semnal rămas după fiecare competiție, comparativ cu DO (405 nm) măsurat în absența concurenților.,
O procedură similară a fost utilizată pentru AmtDNA-ELISA, folosind concentrații crescute (0, 3, 9 și 27 ng/µL) de concurente ADN (extras din nuclee sau mitocondriile, cu sau fără S1 nuclează de tratament).comparațiile între grupuri au fost făcute folosind fie testul T al elevului, testul Wilcoxon, testele Friedman sau Kruskal-Wallis, ANOVA unidirecțională, măsuri bidirecționale sau repetate ANOVA în funcție de rezultat, precum și numărul și tipul de grupuri., Atunci când mai multe comparații diferitelor autoturisme au fost evaluate, corespunzătoare post-hoc corectare teste au fost folosite, cum ar fi Dunn, testul Dunnett, Sidak sau Bonferroni lui. Asociații între AwMA, AmtDNA și anti-HSP60 au fost calculate cu corelațiile Spearman. Distribuția acestor anticorpi în funcție de rezultatele ACA au fost comparate folosind testul Wilcoxon. Asociațiile dintre AwMA sau AmtDNA și rezultatele clinice au fost studiate prin regresii liniare și logistice bivariate și multivariate., Rezultatele clinice studiate sunt medii intima-media thickness, modificarea procentuală a fluxului mediată de dilatare (FMD) a arterei brahiale, prezența febrei aftoase, prezența de plăci în carotidă, eveniment trombotic vreodată, leucocite, trombocite, creșterea ADN-ul obligatoriu de Farr testul de mai sus limite normale pentru testarea de laborator, prezența de leziuni potrivit SLICC Daune Index (SDI > 0), de înaltă activitate în conformitate cu SLEDAI-2K (scorul de activitate a SLEDAI ≥ 4), prezența lupus nefrită, biopsie de clasă, precum și cronicității și indicele de activitate de la biopsie., Acestea din urmă au fost ajustate pentru durata bolii, vârsta, indicele de masă corporală (IMC), lipoproteinele cu densitate scăzută (LDL) colesterol, medicamente antimalarice și prednison. Regresiile logistice sunt prezentate cu rapoarte impare și intervalul lor de încredere 95% Wald. Participanților rezultatele au fost considerate pozitive pentru AwMA și AmtDNA când valoarea acestora a fost de mai sus valoarea-limită identificate după maximizarea Youden Index. Un interval de încredere de 95% a fost obținut pentru cut-off folosind 10.000 de probe bootstrap. Măsurile de performanță sunt prezentate cu intervalul de încredere exact de 95%.,
software-ul
imaginile Western blot au fost achiziționate folosind Image Studio Digits 5.2 (biotehnologie LI-COR). migrarea mtDNA prin gel de agaroză a fost imaginată utilizând Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). Studiile DLS au fost efectuate folosind software-ul încorporat Zetasizer 7.10 (instrumente Malvern). Imaginile EM au fost achiziționate cu software-ul de captare a imaginii 601.384 (Advanced Microscopy Techniques corp., Woburn, MA, SUA). Citometria în flux a fost efectuată utilizând BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biosciences). Randamentele din izolațiile ADN au fost cuantificate folosind ND-1000 3.8.,1 software-ul (Thermo Fisher Scientific) și qPCR au fost efectuate cu RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Densitățile optice au fost măsurate utilizând SoftMax Pro 5.4.1 (dispozitive moleculare). Cifrele au fost asamblate cu ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, SUA) și Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, SUA). Analizele statistice au fost efectuate cu Prism 7 software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SUA) și SAS versiunea 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA).