PMC (Română)
discuție
este important să se coreleze variațiile genelor cu fenotipurile clinice folosind instrumente adecvate de fenotipare a activității CYP3A4. 3-hidroxilarea chininei a fost dovedită ca reacție biomarker pentru activitatea CYP3A4, deoarece 3-hidroxilarea chininei este catalizată de CYP3A4 atât in vivo, cât și in vitro (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu și colab., 2011)., Prin urmare, parametrii cinetici ai catalizei enzimatice asupra hidroxilării chininei 3 au fost utilizați ca măsură a activității CYP3A4 în studiul de față.douăzeci și trei dintre holoenzimele CYP3A4 recombinante au prezentat o scădere semnificativă a CLint față de chinină. Șase variante, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift), și CYP3A4*21 (Y319C), expuse mult mai mici CLint pentru chinină (1.44–5.80%, Tabelul 2) de tip sălbatic CYP3A4*1A., Dacă constatările in vitro sunt reproduse în studiile clinice, pacienții care sunt purtători de aceste alele pot fi potențial CYP3A4 săraci-metabolizers și poate: i) de a solicita mai mici doze de chinină pentru a ajunge la concentrații plasmatice terapeutice; și ii) să fie la risc crescut pentru reacții adverse și toxicitate atunci când convenționale doze de chinină sunt utilizate.
CYP3A4 * 2 (s222p) a prezentat un CLint redus de peste șase ori (14, 76%, Tabelul 2) pentru chinină, comparativ cu CYP3A4*1a de tip sălbatic., Această activitate enzimatică scăzută s-ar putea datora faptului că o substituție de aminoacizi serină→prolină ar putea provoca o schimbare majoră în structura tridimensională a enzimei (prolină este cunoscută pentru a rupe alfa-helices). De asemenea, s-a raportat că CYP3A4*2 posedă un CLint mai mic pentru midazolam (Miyazaki et al., 2008), nifedipină (Sata și colab., 2000; Miyazaki și colab., 2008), ibrutinib (Xu și colab., 2018) și lidocaină (Fang și colab., 2017), decât cea a enzimei de tip sălbatic. În schimb, CYP3A4 * 2 a arătat un CLint mai mare pentru amiodaronă (Yang et al., 2019)., Pentru testosteron, CYP3A4 * 2 a avut un clearance intrinsec scăzut atunci când a fost exprimat prin sistemul Escherichia coli express in vitro (Miyazaki et al., 2008), dar activitatea a fost comparabilă cu enzima de tip sălbatic atunci când este exprimată în sistemul de Expresie baculovirus (Sata et al., 2000) (Tabelul 3).
CYP3A4 * 3 (M445T) a prezentat o activitate enzimatică mai scăzută față de chinină, comparativ cu alela de tip sălbatic (Tabelul 2)., Reziduul de aminoacizi 445 este localizat în regiunea conservată de legare a hemei, doar două terminale C de aminoacizi la Cys absolut conservate la poziția 442 în proteina CYP3A4 (Sata et al., 2000); prin urmare, o modificare Met445Thr poate exercita un efect nefavorabil asupra legării hemei, ducând la o modificare a activității catalitice a enzimei, în special atunci când se leagă un substrat adecvat. Dar, așa cum s-a menționat în tabelul 3, activitatea enzimatică a CYP3A4*3 a fost similară cu cea a CYP3A4 de tip sălbatic pentru majoritatea substraturilor testate., Discrepanța rezultatelor ar putea apărea din diferite metode de Expresie heterologe utilizate și din cauza specificității diferite a substratului pentru variantă.
CYP3A4*4 (I118V) expuse mai mică CLint față de chinină, în raport cu tipul sălbatic CYP3A4*1A. Studii de site-regizat de mutageneză sugerează că ser119 este o cheie aminoacid implicat activ site-ul de reziduuri (Yano et al., 2004). Prin urmare, mutația Ile118Val este probabil să afecteze conformația situsului activ, ducând la scăderea activității catalitice., În mod similar, un studiu in vivo au arătat că raportul dintre urinar nivel de 6β-hydroxycortisol/gratuit cortizol în aceste indivizii heterozigoți fost mai scăzută decât la subiecții sănătoși, sugerând scăzut activități enzimatice (Hsieh et al., 2001).ambele variante CYP3A4 * 8 și * 13 au prezentat niveluri detectabile, deși mai scăzute, de holoproteine CYP3A4 și au avut activități catalitice extrem de scăzute față de chinină. Contrar rezultatelor noastre, s-a raportat că CYP3A4*8 și *13 nu prezintă holoproteine CYP detectabile atunci când sunt exprimate în sisteme bacteriene (eiselt et al., 2001)., Speculăm că utilizarea sistemelor de Expresie bacteriene vs. insecte poate explica rezultatele diferite. Sistemul de Expresie bacteriană nu are un mediu membranar intracelular (Gonzalez și Korzekwa, 1995) necesar pentru exprimarea ridicată a proteinelor. În schimb, celulele insectelor pot procesa și modifica proteinele într-un mod similar celulelor umane, permițând plierea corespunzătoare a enzimei și încorporarea cofactorului hem, rezultând o expresie mai mare a proteinelor CYP3A4.,
CYP3A4*11 (T363M) a fost exprimată la niveluri semnificativ mai mici decât cele sălbatice-tip CYP3A4 (Figura 2), o constatare care este în concordanță cu studiile folosind bacteriene sau de mamifere sisteme de expresie (Eiselt et al., 2001; Murayama și colab., 2002). Treonina la reziduul 363 din situsul de recunoaștere a substratului (SRS)-5 poate contribui la formarea rețelei de legare a hidrogenului. O substituție de la treonină la metionină ar putea duce la pierderea activității catalitice (Murayama et al., 2002). Astfel, CYP3A4 * 11 a prezentat o activitate redusă de hidroxilare a chininei în studiul actual., În plus, CYP3A4*11 a prezentat o activitate redusă de hidroxilare a testosteronului (Murayama et al., 2002), a crescut remarcabil CLint față de lidocaină (Fang et al., 2017) și amiodaronă (Yang și colab., 2019), dar nu a fost asociat cu modificări vizibile ale activităților metabolice pentru ibrutinib (Xu et al., 2018) (Tabelul 3).
CYP3A4*12 (L373F) a afișat un scăzut dramatic CLint față de chinină, în mod similar cu un cercetările anterioare duce spre midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4*12 posedă un amino-acid schimbare de Leu373Phe; mutante reziduuri este situat în apropiere Arg-372 și Glu-374, care participa la formarea de hidrogen legătură de rețea și sunt implicate în site-uri active în funcție de studiile pe site-regizat de mutageneză (Yano et al., 2004). Prin urmare, mutatii de reziduuri (L373F) este de natură să afecteze stabilitatea de hidrogen legătură de rețea și conformație de active-ului cavitate, care rezultă în a modificat activitatea catalitică a CYP3A4*12.,
CYP3A4*20 (488 frameshift) a arătat extrem de diminuat apoprotein expresia (Figura 1) și redus dramatic CLint față de chinină. În schimb, nu au fost raportate activități catalitice de midazolam 1 ‘ -și 4-hidroxilare în drojdie sau microzomi HEK 293 care exprimă CYP3A4*20 (Westlind-Johnsson et al., 2006). Aceste rezultate contradictorii pot fi atribuite diferitelor sisteme de Expresie heterologe și substraturi utilizate în experimente. În plus, s-a raportat că un heterozigot CYP3A4*20, identificat la indivizi Brazilieni, prezintă un clearance sistemic redus de ∼1.,De 9 ori pentru midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Sa presupus anterior că această mutație rară ar putea influența plierea proteinelor ,încorporarea hem (Westlind-Johnsson et al., 2006) și conformația spațială a cavității situsului activ, dând naștere la o scădere sau pierdere a activității catalitice asociate cu substratul utilizat.CYP3A4 * 21(Y319C), care a fost identificat în populația chineză (Zhou et al., 2011), a prezentat o activitate catalitică slabă față de chinină în studiul nostru. Interesant este că în rezultatele noastre nu a fost identificată nicio Expresie apoenzimă detectabilă., Tyr319 este un reziduu foarte conservat din familia citocromului P450 pe parcursul evoluției eucariotelor de la nematod la om (Zhou et al., 2011). Conform predicțiilor funcționale din silico (Zhou et al., 2011), reziduul Tyr319 se află pe un domeniu important și o substituție a Tyr cu Cys la poziția 319 a proteinei CYP3A4*21 poate induce modificări dramatice în configurația cavității situsului activ. Prin urmare, CYP3A4*21 poate produce o proteină funcțională defectuoasă cu activitate catalitică redusă față de chinină., În plus, am speculat că acești anticorpi-am folosit pentru a detecta CYP3A4 recombinant apoproteins nu pot fi potrivite pentru a detecta varianta CYP3A4*21. Adică mutația Tyr319Cys în CYP3A4 * 21 poate împiedica acești anticorpi să recunoască epitopii specifici din CYP3A4.
În schimb, două dintre recombinant CYP3A4 holoenzymes, CYP3A4*15 (R162Q) și CYP3A4*29 (F113I), afișat în mod semnificativ a crescut CLint pentru chinină. În mod similar, atât CYP3A4*15, cât și CYP3A4*29 au prezentat o creștere a CLint față de lidocaină (Fang et al., 2017), dar a arătat scăderea CLint pentru ibrutinib (Xu et al., 2018)., CYP3A4 * 15 a fost detectat mai întâi la diferite populații etnice, cu probe mici pentru fiecare grup etnic (Lamba et al., 2002). CYP3A4*29 a fost identificat și denumit în studiul nostru recent (Hu et al., 2017). Cele două variante sunt legate de metabolismul rapid al chininei in vitro. Dacă se constată confirmarea creșterii clearance-ului chininei la persoanele care sunt purtători homozigoți sau heterozigoți ai CYP3A4*29 sau CYP3A4*15, acești indivizi pot fi metabolizatori ultra-rapizi ai chininei CYP3A4., Pacienții cu aceste genotipuri pot: i) să aibă o eficacitate terapeutică mai scăzută atunci când se administrează doze clinice uzuale de chinină; și ii) să necesite doze mai mari pentru a atinge concentrațiile plasmatice terapeutice.
Nu activ holoenzymes de CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop), și CYP3A4*30 (R130Stop) variantele au fost detectate și, în consecință, au prezentat nici o activitate metabolică asupra chinină (Tabelul 2).,
CYP3A4*6 are o inserție de reziduuri de adenină în exonul 9 (830-831 insA); aceasta provoacă o mutație frameshift și conduce la traducerea unui trunchi de proteine, care nu poate să includă hem (Hsieh et al., 2001). În consecință, activitatea catalitică a CYP3A4 * 6 față de chinină nu a fost identificată în studiul nostru. Așa cum am arătat anterior, in vivo, un Chinez a fost găsit pentru a fi heterozigoți pentru CYP3A4*6 cu un mult mai mic raport de urinare nivel de 6β-hydroxycortisol:gratuit cortizol decât de tip sălbatic persoane, sugerând că a scăzut activitatea CYP3A4 (Hsieh et al., 2001)., În mod similar, un pacient care este heterozigot pentru CYP3A4*6, supus unui transplant de organ, a avut un raport concentrație-doză ajustată de tacrolimus de 4,3 ori mai mare decât cel al pacienților de tip sălbatic (Jun et al., 2009).
CYP3A4 * 26 are o substituție a nucleotidelor C→T în exonul 5. Aceasta determină o schimbare de la arginină la un codon de oprire prematură la poziția 268 și are ca rezultat o proteină scurtă presupusă lipsită de domeniu catalitic și, prin urmare, de activitate (Werk et al., 2014)., CYP3A4 * 26 nu poate fi exprimat din cauza codonului Stop prematur în poziția 268 sau, dacă este cazul, proteina poate fi marcată pentru degradare rapidă (Werk et al., 2014). În consecință, nu am putut detecta holoproteina variantei CYP3A4 * 26 exprimată în celule Sf21. De asemenea, un tânăr de 19 ani, rinichi transplantat pacientului, identificat ca un homozigotă pentru CYP3A4*26 și, între timp, de asemenea, un homozigotă pentru CYP3A5*3, a expus o neașteptat de mare a concentrației plasmatice de tacrolimus, ca urmare a extrem de diminuat tacrolimus clearance-ul (Werk et al., 2014).,
Similar cu CYP3A4 * 26, CYP3A4*30 are o schimbare de la arginină la un codon Stop prematur la poziția 130 (Hu et al., 2017). Arg130 este considerat important pentru încorporarea heme (Eiselt et al., 2001) și, astfel, mutația Arg130 ar perturba încorporarea hemei și ar afecta astfel expresia holoenzimei CYP3A4.în asociere cu studiile anterioare (Tabelul 3), unele variante alelice ale CYP3A4 au prezentat diferite preferințe pentru substraturi, spre deosebire de cele ale enzimelor de tip sălbatic. Anume, unele variante prezintă activități catalitice modificate cu un profil dependent de substrat., După cum sa discutat mai sus, rezultatele conflictuale care derivă dintr-un substrat specific în studii pot apărea din mai mulți factori, cum ar fi discrepanțele dintre metoda in vitro sau in vivo și diferite sisteme de Expresie heterologă.chinina are efecte adverse frecvente, datorită indicelui său terapeutic îngust (Bateman și Dyson, 1986). Aceste reacții adverse nu au fost induse doar de medicamente; ele au fost, de asemenea, cauzate de băuturi comune care conțin chinină., Pe baza unei revizuiri sistematice a datelor clinice din o sută paisprezece articole, reacțiile adverse, care au fost rezultate din băuturile care conțin chinină, au reprezentat 20% din totalul reacțiilor adverse la chinină (Liles et al., 2016). Surprinzător, chiar și cu expunerea minut de băuturi comune, unele persoane au prezentat reacții adverse severe care implică mai multe sisteme de organe. Având în vedere diversitatea interindividuală evidentă a sensibilității la chinină, variația CYP3A4 poate fi un posibil mecanism care stă la baza sensibilității la chinină și a efectelor adverse., În plus, reglementările privind utilizarea chininei nu au fost stabilite în unele țări, cum ar fi pastilele care conțin 50 mg sau mai puțin de chinină sunt considerate un produs natural de sănătate și sunt disponibile fără prescripție medicală în Canada (Liles et al., 2016); loțiuni și șampoane care conțin chinină, precum și băuturi care conțin chinină, rămân disponibile în mod obișnuit și nu este necesară supravegherea. Astfel, se consideră că este necesară o conștientizare sporită a diferențelor interindividuale în ceea ce privește sensibilitatea la chinină și reacțiile adverse la chinină în rândul medicilor și al publicului.