Anti-mitokondrie-autoantikroppar i systemisk lupus erythematosus och deras samband med sjukdom manifestationer
Studie godkännande
patientgrupp
Den mänskliga serum testas i denna studie erhölls från en University Health Network forskningsetik styrelsen (REB) godkänd studie av SLE och APS patienter i Toronto samt från friska kontroller och PBC patienter rekryterade från CHU de Québec – Université Laval REB godkända studier i Quebec City., SLE-patienter måste uppfylla 1982 ACR-klassificeringskriterierna för SLE reviderad 199781,82 och APS-patienter uppfyllde 1999 Sapporo-kriterierna för APS reviderade 200683,84. För SLE, konsekutiva kvinnliga patienter från University of Toronto Lupus Klinik (UTLC) kontaktades och gett sitt samtycke mellan augusti 2010 och oktober 2011 att vara en del av en studie om betydelsen av fettsyror och hjärt-kärlsjukdom vid lupus. De gav ett blodprov och hade sina anonymiserade kliniska data kopplade till deras biospecimen., På samma sätt närmade sig APS-patienter som sågs vid reumatologikliniken i Toronto efter ett liknande förfarande. Alla återstående biospecimen kan användas för framtida studier av biomarkörer av lupus enligt de ursprungliga försökspersonernas samtycke. Friska försökspersoner rekryterades som en del av studien på markörer för inflammation om de inte hade några kända sjukdomar och inte hade smittsamma symptom vid tidpunkten för blodprovet. Ålder och kön samlades vid den tiden. PBC-patienter uppfyllde 2009 PBC-klassificeringskriterierna, reviderade 201838,85 inklusive positiviteten för anti-mitokondriella antikroppar.,
Data från kliniska laboratorier
För SLE-patienter, anti-dsDNA mättes med Farr analys (laboratorium cut-off på 30 procent) och anti-kardiolipin (IgG och IgM – laboratoriet cut-off av 40 GPL eller MPL-enheter) mättes med ELISA i ett kliniskt laboratorium.
cellodling
inducerbar musmodell av SLE
rekommendationer från det kanadensiska rådet för djurvård följdes i ett protokoll som godkändes av Djurskyddskommittén vid Université Laval., C57BL/6 J erhölls från Jackson Laboratorier (Bar Harbor, ME, USA) och är inrymt i en Elit-Plus specifikt patogen fri djur anläggning på CHU de Quebec. SLE autoantikroppar inducerades i dessa möss som tidigare beskrivet63. I korthet, 6-8 veckor gamla manliga möss fick 100 µL jag.v. injektioner av ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove IL, USA), följt 24 h senare av en 100 µL jag.v. injektion av lipopolysaccharide (LPS från E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Dessa injektioner upprepades efter 2 och 4 veckor för totalt tre omgångar av immuniseringar och möss blödde 48 h efter den tredje immuniseringen. C57BL / 6 j möss injicerade i. v. med PBS enligt samma schema användes som kontroller.
etik
under hela studien erhölls blodprov från patienter med informerat samtycke. Alla metoder som presenteras i denna studie utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter för både mänskliga och murina givare.,
mitokondrie isolering
mitokondrier isolerades från lever av C57BL/6 j möss efter en kombination av publicerade protocols61,62. Möss offrades av cervikal dislokation, levern avlägsnades snabbt, gallblåsan skars ut och levern sköljdes i iskalla PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., Levern maldes sedan och överfördes till en förkyld glas / Teflon vävnadskvarn innehållande 12 mL iskall mitokondriell isoleringsbuffert (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM sackaros) per gram lever sedan maldes tills en homogen suspension erhölls. Intakta celler och kärnor pelleterades två gånger vid 700 g, 4 ° C, 10 min. Kontaminerande membran, proteiner och organeller eliminerades av två centrifugeringar vid 7 000 g, 4 °C, 10 min följt av en centrifugering vid 10 000 g, 4 °C, 10 min., Den råa mitokondriella suspensionen renades ytterligare genom ultracentrifugation mot en Perkollgradient (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v:V Percoll) vid 95,000 g, 4 °C, 30 min. Bandet innehållande mitokondrier samlades i PBS. Ett liknande tillvägagångssätt användes för att isolera mänskliga mitokondrier med undantag för att upp till 107 Hep – G2-celler lyserades av upprepade passager genom en smalspårig nål., Den kommersiella kit QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Tyskland) användes också, enligt tillverkarens instruktioner, för att isolera mitokondrier från Hep-G2-celler för kvalitetsjämförelse genom western blotting med ovannämnda protokoll. Isolerade mitokondrier doserades med bicinkoninsyrametoden (BCA) med användning av BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA). Nyligen isolerade mitokondrier användes i alla experiment med undantag för submitochondrialpartiklarna preparat för vilka pelleterade mitokondrier hölls vid -80 °C tills det behövdes.,
Submitochondrial particles (SMP) preparation
SMP framställdes enligt beskrivning elsewhere60. Kort sagt tinades frusna mitokondrier vid rumstemperatur och späddes till 10 mg mitokondriella proteiner i 10 mM 4-Morfolinepropansulfonsyra (MOPS). Prov sonicated sedan med hjälp av en Fisher Sonic Dismembrator Modell 500 (Thermo Scientific) vid 20% maximal effekt i 20 sekunder sedan hålls på en saltis vattenbad under 10 minuter. Denna cykel upprepades nio gånger., Prover centrifugerades sedan vid 16 000 g, 4 ° C, 10 minuter för att kassera obruten mitokondrier och andra oönskade skräp. Supernatanter samlades i ett nytt rör och deras volymer justerades till 2 mL i 10 mM Moppar. Proverna var sedan ultracentrifugade vid 150 000 g, 4 °C i 45 minuter. Pelleterad SMP återsuspenderades i SMP-buffert (225 mM mannitol, 75 mM sackaros, 10 mm HEPES, 0, 1 mM EDTA, pH 7, 4) och doseras. SMP-preparat hölls vid -80 °C tills det behövdes.,
beredning av röda blodkroppar mikropartiklar (RBCMP)
röda blodkroppar (RBC) isolerades från blodet hos friska frivilliga försökspersoner genom centrifugering vid 282 G i 10 minuter vid RT. Trombocytrik plasma och buffy coat kasserades och RBC-fraktionen hölls. RBC räknades (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) och ändras till en koncentration på 5 x 108 celler/mL i Tyrode buffer (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glukos, 10 mM HEPES -, pH 7.4)., 109 celler späddes sedan i 45 mL dubbeldestillerat vatten och inkuberades i 5 minuter. Buffertens tonicitet balanserades sedan genom tillsats av 5 ml PBS 10X (filtrerad genom ett 0,22-µm membran). Rest RBC avlägsnades genom centrifugering vid 1,300 G i 5 minuter vid RT och supernatanten centrifugerades vid 18,000 G i 90 minuter vid 18 ° C. RBC mikropartikelpellet suspenderades sedan i 500 µl PBS. Proteinkoncentrationen mättes med BCA-analys.,
Western blotting
Mitochondrial size measurement by dynamic light scattering (DLS)
storleken på den isolerade mitokondrierna mättes med DLS, med hjälp av en Zetasizer Nano ZS-enhet (Malvern instruments, Malvern, UK) utrustad med standard 4 mW, 633 nm he-Ne-laser som ljuskälla, inställd i en detekteringsvinkel på 173°. Experiment replikerades tre gånger i 1 cm långa engångs UV-kyvetter (varumärke GMBH, Wertheim, Tyskland) innehållande 100 µL isolerade Murin mitokondrier utspädda i PBS vid en koncentration av 10 µg proteiner/µL., Följande parametrar beaktades vid mätning av mitokondriens storlek: lösningsmedlets brytningsindex: 1.330, viskositeten hos provet: 0.8872 mPas, brytningsindex för proteinerna: 1.45, temperatur: 25 ° C.
elektronmikroskopi
mitokondrier (108) fixerades i 3.5% akrolein i 15 min vid rumstemperatur. Fasta prover sköljdes två gånger i PBS och inbäddades sedan i 4% agaros. 50 µm-sektioner klipptes med hjälp av en vibratom, post-fixerad i 1% osmiumtetroxid i 30 minuter och inbäddad i Durcupanharts., Sjuttio-nanometer ultratunna avsnitt synliggjordes vid 80 kV med hjälp av en Tecnai G2 Ande BioTWIN (FEI, Hillsboro, ELLER, USA) elektronmikroskop.
bedömning av mitokondriell syreförbrukning
mitokondrier resuspenderades i mitokondriell analyslösning (MAS: 70 mM sackaros, 220 mM mannitol, 10 mm KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA och 0,2%(w/v) fettsyrafri BSA, pH 7,4 vid 37 °C) och kompletterad med 10 mM pyruvat, 2 mM malat och 4 µM FCCP , pH 7,4. En motsvarande 10 µg proteiner var seedad på XF-96 plattor (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Plattorna centrifugerades sedan 2000 g för 20 min vid 4 ° C. Vi visualiserade fördelningen av mitokondrier under ett ljusfältsmikroskop för att säkerställa vidhäftning och homogen ompartition. Plattorna hölls vid 37 ° C utan CO2 i cirka 40 minuter före lastning. Syreförbrukningen (OCR) mättes i enlighet med tillverkarens anvisningar (Agilent/Seahorse Bioscience). Experiment replikerades i tre brunnar och i genomsnitt för varje experimentellt tillstånd., Totalt gjordes 3 mätningar av syreförbrukningen för varje tillstånd ungefär var 6: e minut under basala förhållanden och efter Sekventiell tillsats av rotenon (2 µM), succinat (10 mM), antimycin A (40 µM) och TMPD (N,n,n’,n’-tetrametyl-p-fenylendiamin)/askorbat (100 µM/10 mM). Succinat användes som elektrondonator för komplex II, rotenon som en komplex i-hämmare, antimycin A som en komplex III-hämmare och andning genom komplex IV mättes med TMPD/askorbat.,
högkänslig flödescytometri
på grund av sin ringa storlek upptäcktes mitokondrier av högkänslig flödescytometri med hjälp av ett ”litet partikelalternativ” bestående av en framåtriktad spridning (FSC) kopplad till ett fotomultiplikatorrör (PMT) monterat på en BD FACS Canto II Special Order research Product (SORP, BD Biosciences). Mitokondrier (0.5 µg) var målat med 1 µg anti-TOMM22-Atto 488 (klon IC9-2, Sigma-Aldrich) och 1 µM av mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 30 minuter vid 37 °C och späds ut med PBS till en slutlig volym på 500 µl innan flödescytometrisk analys., För att kvantitativt mäta antalet mitokondrier använde vi 3 µm diameter polystyrenmikrosfär (Polysciences, PA, USA). 80 000 mikrosfärer tillsattes till varje prov och 500 mikrosfärer förvärvades. Kiselpartiklar (Kisker Biotech, Steinfurt, Tyskland) användes för att bestämma 100-1,000 nm storleksskala.
mitokondriell DNA-extraktion genom alkalisk Lys
isolerade mitokondrier pelleterades vid 10 000 g, 4 °C, 10 min och resuspenderades i 0, 8 mL mtDNA isoleringsbuffert A för varje 3 mg mitokondriella proteiner., Mitokondrier lyserades sedan i en volym (v:v) mtDNA isoleringsbuffert B (extemporöst beredd. 0,2 M NaOH, 1% SDS) i 3 min. på is, under mild agitation. mtDNA-suspensioner neutraliserades med en volym (v:v) mtDNA isoleringsbuffert C (1.32 m kaliumacetat, pH 4.8 justerat med iskall ättiksyra) i 5 min. på is, under mild agitation. Mitokondriella skräp pelleterades av centrifugering i 10 minuter vid 14 000 g, RT. Supernatanter överfördes till färska rör. mtDNA fälldes ut över natten vid -20 ° C med 0.,1 volym (v:v) kaliumacetat (stamlösning: 3 m natriumacetat, pH justerat till 5,2 med iskall ättiksyra) och 0,7 volym (v:v) absolut isopropanol. mtDNA pelleterades sedan vid 14,000 g, tvättades tre gånger med 1.5 mL 70% etanol och resuspenderades i DNA-resuspensionsbuffert (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0). Mitokondriell DNA-koncentration bestämdes av spektrofotometri (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
kärnor isolering från mus hepatocyter
kärnor isolerades från mus lever med publicerade metoder86., Kort sagt, under mitokondrie isolationsprotokoll, medan supernatanter användes för att utföra mitokondrie isolationer, återsuspenderades pellets från den första 700 g-centrifugeringen i 10 mL iskalla kärnor isoleringsbuffert a (5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 mM sackaros. pH 7.4) och mals i en förkyld glas / Teflon vävnadskvarn. Suspensionen stördes ytterligare av tre passager genom en 25 G5/8 gauge nål följt av två passager genom en 27 g ½ gauge nål., Suspensionen filtrerades sedan mot en 40 µM nyloncellsil (Thermo Fisher Scientific) och centrifugerades vid 600 g, 4 °C, 10 min. Pellets återsuspenderades i 14 mL buffert A och centrifugerades vid 600 g, 4 ° C, 10 min. Pellets återsuspenderades sedan i 9 volymer av iskalla kärnor isoleringsbuffert B (1 mm MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 2,0 m sackaros. pH 7.4) och centrifugeras vid 16.000 g, 4 ° C, 30 min. Pellets återsuspenderades i 200 µL PBS och förvarades vid -20 °C.,
helcells-och nukleär DNA-isolering
DNA från antingen 25 mg helmuslever eller 200 µL eller isolerade kärnor extraherades med QIAmp ® DNA Mini Kit (QIAgen), enligt instruktioner från tillverkaren. Prover eluerades i DNA-resuspensionsbuffert.,
Mitokondrie-DNA och kärn-DNA enrichments av qPCR
Trettio nanogram av mitokondrie-DNA och kärn-DNA eller samma mängd av den totala DNA som extraherats från hela musen levern med hjälp av de ovan nämnda protokoll, förstärktes i en Rotor-Gene Q realtid qPCR cykler (QIAgen) enligt standard protokoll med SsoAdvanced Universal SYBR® Green Supermix ’ (BioRad) i en 10 µL reaktion volym., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
mitokondriell DNA-digestion genom restriktionsenzymer
renad mus mtDNA smältes av Hae II eller PST i-begränsning endonukleaser (NEB, Whitby, ON, Kanada) enligt tillverkarens protokoll. Uppslutna produkter (1, 5 µg) erhölls sedan på en agarosgel på 0, 5% (w/v). Bilder förvärvades på en Chemidoc MP geldokumentationssystem (Bio-Rad). Fullängdsgel presenteras i kompletterande Fig. 6d.,
S1 nuclease behandling av mitokondrie-DNA och kärn-DNA
30 µg av mtDNA och nDNA var utspädd i 200 µL av 1X S1-buffert och behandlas med 50 U S1 nuclease (Thermo Fischer Scientific) i 5 minuter vid 37 °C. Reaktionen blev stoppad av tillägg av 600 mM EDTA (slutlig koncentration) och inkubation vid 70 °C i 10 minuter. Proverna utfälldes genom tillsats av 300 mM natriumacetat (slutkoncentration) och 2 volymer (v:v) absolut etanol i 16 timmar vid -20 °C., Proverna pelleterades vid 14,000 g, RT, 20 minuter och tvättades 1 mL 70% etanol och resuspenderades i DNA-resuspensionsbuffert. För konkurrensanalyser följde obehandlade nDNA och mtDNA samma behandling utan tillsats av enzymet. Prover doserades av qPCR.
mitokondriell oxidation in-vitro
doserade mitokondrier pelleterades och resuspenderades vid en koncentration av 1, 5 mg mitokondriella proteiner / mL i PBS innehållande 500 µM av oxidanten tertbutylhydroperoxid (Tbhp) (Sigma-Aldrich)., Mitokondrier oxiderades för 1 h 30 min vid 37 ° C under mild agitation sköljdes sedan två gånger med iskalla PBS. Oxiderade mitokondrier kvantifierades därefter av BCA.
mitokondriell lipidoxidation
bildandet av Tiobarbitursyrareaktiva ämnen (TBARS) bedömdes med hjälp av Parametersatsen Tbars (R&d-system, Minneapolis, MN, USA), enligt tillverkarens instruktioner. Tvåhundra mikrogram mitokondrier lyserades, proteinerna utfälldes med användning av triklorättiksyra (TCA) och pelleterades vid 12 000 g, rumstemperatur, 4 min., Supernatanterna överfördes till färska rör. Prover (75 µL) inkuberades med 37,5 µL av thiobarbituric syra i en platta med 96 brunnar för 3 h vid 50 °C. Absorbanser läsa på 532 nm på en SpectraMax 190 mikroplattsläsare som läsare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) och TBARS kvantifieringen utfördes med hjälp av en standardkurva som tillhandahålls i satsen. Oxiderade prover jämfördes med kontroll mitokondrier som inkuberades under samma förhållanden i PBS utan TBHP.,
mitokondriell proteinoxidation
bildandet av karbonyldelar efter mitokondriell oxidation in vitro mättes med användning av Protein Carbonyl Content Assay Kit (Sigma Aldrich) enligt tillverkarens instruktioner. Oxiderade prover jämfördes med kontroll mitokondrier som inkuberades under samma förhållanden i PBS utan TBHP.,
detektion av antikroppar riktade mot mitokondriella epitoper av ELISA
för detektering av anti-hel mitokondriella antikroppar (AwMA) späddes Murin mitokondrier (500 µg/mL) i 50 mM karbonat/bikarbonatbuffert, pH 9.6 och 25 µL per brunn laddades på 96-brunns halv-area clear flat bottom polystyren High-binding microplates (Corning, New York, USA). Plattorna beläggs för 18 h vid 4 ° C och blockerades sedan för 4 h vid 37 ° C med PBS innehållande 10% FBS och 0,5% gelatin. Efter tre tvättar med PBS, sera utspädd 1: 150 (om inte annat anges) i PBS-10% FBS-0.,3% gelatin inkuberades över natten vid 4 ° C i två exemplar. Efter tre tvättar med PBS inkuberades plattor för 1 h vid rumstemperatur med alkaliskt fosfatas-(AP) konjugerad get anti-mus eller anti-human IgG (Sigma-Aldrich) utspädd 1:1,000 i PBS-0.4% bovint serumalbumin (BSA). Plattorna tvättades tre gånger med PBS och utvecklades med p-nitrofenolfosfat (p-NPP) för ~30 min vid 37 °C och optiska densiteter (od) lästes vid 405 nm på en mikroplatläsare., Samma protokoll användes för detektering av autoantikroppar riktade submitokondriella partiklar genom att använda 25 µL per brunn av SMP utspädd (50 µg/mL) i 50 mM karbonat/bikarbonatbuffert, pH 9.6. Ett liknande tillvägagångssätt användes för Human mitokondrier med följande modifiering: plattor inkuberades med en pepparrotperoxidas-konjugerad anti-human IGG sekundär antikropp (1: 3000), peroxidas-aktivitet avslöjades vid rumstemperatur för ~5 min med 3,3′, 5, 5′ – tetrametylbensidin (TMB). Reaktionen stoppades med 2 N H2SO4 och ODs läses vid 450 nm., För anti-mtDNA ELISA var plattorna förbelagda med 1% protaminsulfat i dubbeldestillerat vatten för 1 h vid rumstemperatur. Plattorna tvättades tre gånger med PBS och beläggs över natten vid 4 ° C med 400 ng mtDNA i PBS. Alla efterföljande steg var identiska med de som användes för AwMA-ELISAs. Tomma värden (mitokondriella antigener och inga sera) substraherades från uppmätta värden för varje patient. Under utvecklingen av dessa analyser testades den korrekta beläggningen av brunnarna genom att använda isotyp-matchade monoklonala antikroppar från mus (mAb). En monoklonal antikropp (klon IV.,3, 4 µg/mL) användes som en negativ analyskontroll i varje fall medan olika monoklonala antikroppar användes, beroende på beläggningsantigener, som positiva analyskontroller: en anti-TOMM22 mAb (klon IC9-2, 4 µg/mL. Abcam) för intakt mitokondrier, en anti-DNA-mAb (Klon 35I9 DNA, 10 µg/mL. Abcam) eller en anti-Cytokrom C mAb (Klon 7H8.2C12, 5 µg/mL. BD biovetenskap).,
Tävlingstest
AwMA-ELISAs utfördes enligt beskrivningen i föregående avsnitt med följande ändringar: serumprover förinkuberades i utspädningsbuffert (1:150) med olika koncentrationer (0,25, 1 och 3 mg / mL) av konkurrenter (dvs. mitokondrier eller röda blodkroppar mikropartiklar) under 3 timmar. vid RT och inkuberas i två exemplar över natten vid 4 ° C. Data presenteras som den procentandel av signalen som återstår efter varje tävling, jämfört med OD (405 nm) mätt i avsaknad av konkurrenter.,
Ett liknande förfarande användes för AmtDNA-ELISA, med hjälp av ökade koncentrationer (0, 3, 9 och 27 ng/µL) konkurrerande DNA (utvinns ur kärnorna eller mitokondrierna, med eller utan S1 nuclease behandling).
statistik
jämförelser mellan grupper gjordes med antingen Studentens t-test, Wilcoxon test, Friedman eller Kruskal-Wallis test, envägsanova, tvåvägs eller upprepade åtgärder ANOVA beroende på resultatet, samt antal och typ av grupper., När flera jämförelser bedömdes användes lämpliga korrigeringstester efter hoc, såsom Dunns, Dunnetts, Sidak ’ s eller Bonferronis. föreningar mellan AwMA, AmtDNA och anti-HSP60 beräknades med Spearman korrelationer. Fördelningen av dessa antikroppar enligt ACA-resultat jämfördes med Wilcoxon-test. Associationer mellan AwMA eller AmtDNA och kliniska resultat studerades av bivariata och multivariata linjära och logistiska regressioner., Kliniska resultat som studerats är genomsnittlig intima medietjocklek, procentuell förändring av flödesmedierad dilatation (FMD) av brachialartären, närvaro av FMD, närvaro av plack i halspulsådern, trombotisk händelse någonsin, antal vita blodkroppar, trombocytantal, ökad DNA-bindning genom Farr-analys över det normala intervallet för testlaboratorium, förekomst av skador enligt SLICC-Skadeindex (SDI > 0), hög aktivitet enligt SLEDAI-2K-aktivitetspoäng (SLEDAI ≥ 4), förekomst av skada enligt SLICC-Skadeindex (SDI > 0), hög aktivitet enligt SLEDAI-2K-aktivitetspoäng (SLEDAI ≥ 4), lupus nefrit, biopsi klass, samt kronicitet och aktivitetsindex från biopsi., Den senare justerades för sjukdomstid, ålder, kroppsmassindex (BMI), lågdensitetslipoproteiner (LDL) kolesterol, antimalarial medicinering och prednison. Logistiska regressioner presenteras med udda förhållanden och deras 95% Wald konfidensintervall. Deltagarnas resultat ansågs positiva för AwMA och AmtDNA när deras värde var över det brytvärde som identifierats efter att ha maximerat Youdens Index. Ett 95% konfidensintervall erhölls för cut-off med 10 000 bootstrap-prover. Prestationsåtgärder presenteras med deras 95% exakta konfidensintervall.,
programvara
Western blot bilder förvärvades med hjälp av Bild Studio siffror 5.2 (li-cor bioteknik). mtDNA migration genom agarosgel observerades med Bild Lab 6.0.1 (Bio-Rad). DLS studier genomfördes med hjälp av den inbyggda Zetasizer 7.10 programvara (Malvern Instrument). EM-bilder har förvärvats med Image Capture Software 601.384 (Avancerad Mikroskopi Tekniker Corp, Woburn, MA, USA). Flödescytometri utfördes med hjälp av BD FACSDiva™ 6.1.3 (BD Biosciences). Avkastningen från DNA-isoleringar kvantifierades med nd-1000 3.8.,1 programvara (Thermo Fisher Scientific) och qPCR utfördes med RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Optiska densiteter mättes med SoftMax Pro 5.4.1 (molekylära enheter). Siffror monterades med ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) och Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Bergsutsikt, CA, USA). Statistiska analyser utfördes med Prisma 7 programvara (GraphPad Software Inc. La Jolla, CA, USA) och SAS version 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).