Anti-mitochondriale auto-antistoffen bij systemische lupus erythematosus en hun associatie met de ziekte verschijnselen
Studie goedkeuring
patiëntenpopulatie
De humane sera getest in dit onderzoek werden verkregen uit een University Health Network research ethics board (REB) goedgekeurde studie van SLE en APS patiënten in Toronto, van gezonde controles en PBC patiënten gerekruteerd uit het CHU de Québec – Université Laval REB goedgekeurde studies in Quebec City., SLE-patiënten moesten voldoen aan de ACR-classificatiecriteria van 1982 voor SLE, herzien in 199781,82 en APS-patiënten voldeden aan de Sapporo-criteria van 1999 voor APS, herzien in 200683,84. Voor SLE werden opeenvolgende vrouwelijke patiënten van de University Of Toronto Lupus Clinic (UTLC) benaderd en toestemming gegeven tussen augustus 2010 en oktober 2011 om deel te nemen aan een studie naar de rol van vetzuren en hart-en vaatziekten in lupus. Ze leverden één bloedmonster en hadden hun geanonimiseerde klinische gegevens gekoppeld aan hun biospecimen., Ook APS-patiënten die werden gezien in de Rheumatologie kliniek in Toronto werden benaderd na een soortgelijke procedure. Alle resterende biospecimen konden voor toekomstige studies op biomarkers van lupus vanaf de toestemming van de oorspronkelijke proefpersonen worden gebruikt. Gezonde controle vrijwilligers werden gerekruteerd als onderdeel van het onderzoek naar ontstekingsmarkers als ze geen bekende ziekten hadden en geen infectieuze symptomen hadden op het moment van het bloed afnemen. Leeftijd en geslacht werden verzameld op dat moment. PBC-patiënten voldeden aan de 2009 PBC-classificatiecriteria, herzien in 201838,85 inclusief de positiviteit voor anti-mitochondriale antilichamen.,
gegevens van klinische laboratoria
voor SLE-patiënten werd anti-dsDNA gemeten met behulp van de Farr-test (cut – off in het laboratorium van 30%) en de anti-cardiolipine (cut-off in het IgG-en IgM-laboratorium van 40 GPL-of MPL-eenheden) werden gemeten met ELISA in een klinisch laboratorium.
celcultuur
Induceerbaar muismodel van SLE
aanbevelingen van de Canadese Raad voor de verzorging van dieren werden gevolgd in een protocol dat werd goedgekeurd door de Animal Welfare Committee van de Université Laval., C57BL / 6 J werden verkregen van Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) en gehuisvest in een Elite-Plus specifiek-pathogeen-vrije dier faciliteit in CHU de Quebec. SLE auto-antilichamen werden bij deze muizen geïnduceerd, zoals eerder beschreven 63. Kortom, 6-8 weken oude mannelijke muizen kregen 100 µL i.v. injecties ß2GPI (20 µg) (Crystal Chem, Downers Grove, IL, USA), 24 uur later gevolgd door een 100 µL i.v. injectie lipopolysaccharide (LPS van E. coli, O111:B4; 10 µg) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA)., Deze injecties werden herhaald na 2 en 4 weken gedurende in totaal drie immunisatierondes en muizen werden 48 uur na de derde immunisatie gebloed. C57bl / 6 J muizen die volgens hetzelfde schema i.v. met PBS werden geïnjecteerd, werden als controlegroep gebruikt.
ethiek
gedurende het gehele onderzoek werden bloedmonsters verkregen van patiënten met geïnformeerde toestemming. Alle in dit onderzoek gepresenteerde methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften voor zowel menselijke als muriene donoren.,
mitochondriënisolatie
mitochondriën werden geïsoleerd uit de levers van c57bl/6 j muizen na een combinatie van gepubliceerde protocols 61,62. Muizen werden geofferd door cervicale dislocatie, de lever werd snel verwijderd, de galblaas verwijderd en de lever werd gespoeld in ijskoude PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 19 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)., De lever werd vervolgens fijngemaakt en overgebracht naar een voorgekoelde glas/Teflon weefselmolen met 12 mL ijskoude mitochondriale isolatiebuffer (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 200 mM sucrose) per gram lever vervolgens gemalen tot een homogene suspensie werd verkregen. Intacte cellen en kernen werden tweemaal gepelleteerd bij 700 g, 4 °C, 10 min. Verontreinigende membranen, eiwitten en organellen werden geëlimineerd door twee centrifugaties bij 7.000 g, 4 °c, 10 min, gevolgd door een centrifugatie bij 10.000 g, 4 °c, 10 min., De ruwe mitochondriale suspensie werd verder gezuiverd door ultracentrifugatie tegen een Percoll gradiënt (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 30% v: V Percoll) bij 95.000 g, 4 °C, 30 min. De band met mitochondriën werd verzameld in PBS. Een gelijkaardige benadering werd gebruikt om menselijke mitochondria te isoleren met de uitzondering dat tot 107 hep-G2 cellen door herhaalde passages door een smal-gauge naald werden lysed., De commerciële kit QIAgen Qproteome (QIAgen, Hilden, Duitsland) werd ook gebruikt, volgens de instructies van de fabrikant, om mitochondriën te isoleren van Hep-G2 cellen voor kwaliteitsvergelijking door western blotting met het bovengenoemde protocol. Geïsoleerde mitochondriën werden gedoseerd door de bicinchoninezuur (BCA) methode met behulp van BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher scientific, Waltham, MA, USA). Vers geïsoleerde mitochondriën werden gebruikt in alle experimenten met uitzondering van de submitochondriale deeltjes preparaten waarvoor gepelleteerde mitochondriën werden gehouden bij -80 °C tot nodig.,
submitochondriale deeltjes (SMP) preparaat
SMP werden bereid zoals elders beschreven 60. Kort, bevroren mitochondriën werden ontdooid bij kamertemperatuur en verdund tot 10 mg mitochondriale eiwitten in 10 mM 4-Morfolinepropanesulfonic acid (MOPS). Monsters werden vervolgens gesoniceerd met behulp van een Fisher Sonic Dismembrator Model 500 (Thermo Scientific) met een maximale output van 20% gedurende 20 seconden en vervolgens 10 minuten in een zout-ijswaterbad gehouden. Deze cyclus werd negen keer herhaald., Monsters werden vervolgens gecentrifugeerd bij 16.000 g, 4 °C, 10 minuten om ongebroken mitochondriën en andere ongewenste puin te verwijderen. Supernatants werden verzameld in een verse buis en hun volumes aangepast aan 2 mL in 10 mM MOPS. De monsters werden vervolgens ultracentrifugeerd bij 150.000 g, 4 °C gedurende 45 minuten. Gepelleteerde SMP werd geresuspendeerd in SMP-buffer (225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM HEPES, 0,1 mM EDTA, pH 7,4) en gedoseerd. SMP-preparaten werden op -80 °C gehouden totdat ze nodig waren.,
rode bloedcellen microdeeltjes (RBCMP) preparaat
rode bloedcellen (RBC) werden geïsoleerd uit het bloed van gezonde menselijke vrijwilligers door centrifugeren bij 282 g gedurende 10 minuten bij RT. Bloedplaatjesrijk plasma en buffy coat werden weggegooid en de RBC-fractie bleef behouden. RBC werden geteld (Cellometer Auto M10, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA) en aangepast aan een concentratie van 5 × 108 cellen/mL in Tyrode ‘ s buffer (12 mM NaHCO3, 127 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7,4)., 109 cellen werden vervolgens verdund in 45 mL dubbel gedestilleerd water en gedurende 5 minuten geïncubeerd. De toniciteit van de buffer werd vervolgens gebalanceerd door toevoeging van 5 ml PBS 10X (gefilterd door een membraan van 0,22 µm). Restant RBC werd verwijderd door centrifugeren bij 1.300 g gedurende 5 minuten bij RT en supernatant werd gecentrifugeerd bij 18.000 g gedurende 90 minuten bij 18 °C. RBC microdeeltjes pellet werd vervolgens gesuspendeerd in 500 µl PBS. De eiwitconcentratie werd gemeten met de BCA-test.,
Western blotting
mitochondriale maatmeting door dynamic light scattering (DLS)
De grootte van de geïsoleerde mitochondriën werd gemeten door DLS, met behulp van een Zetasizer Nano ZS-apparaat (Malvern instruments, Malvern, UK) uitgerust met de standaard 4 mW, 633 nm He-Ne laser als lichtbron, ingesteld onder een detectiehoek van 173°. Experimenten werden drie keer gerepliceerd in 1 cm lengte wegwerp UV-cuvetten (Brand GMBH, Wertheim, Duitsland) met 100 µL geïsoleerde muriene mitochondriën verdund in PBS in een concentratie van 10 µg eiwitten/µL., Bij het meten van de grootte van het mitochondrium werd rekening gehouden met de volgende parameters: brekingsindex van het oplosmiddel: 1,330, viscositeit van het monster: 0,8872 mPas, brekingsindex van de eiwitten: 1,45, temperatuur: 25 °C.
elektronenmicroscopie
mitochondriën (108) werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 3,5% acroleïne gefixeerd. Vaste monsters werden tweemaal gespoeld in PBS dan ingebed in 4% agarose. 50 µm secties werden gesneden met behulp van een vibratoom, post-fixed in 1% osmium tetroxide gedurende 30 minuten en ingebed in Durcupan hars., Seventy-nanometer ultrathin secties werden gevisualiseerd bij 80 kV gebruikend een Tecnai G2 Spirit BioTWIN (FEI, Hillsboro, OR, USA) transmissie elektronenmicroscoop.
beoordeling van het mitochondriale zuurstofverbruik
mitochondriën werden geresuspendeerd in een mitochondriale assayoplossing (MAS: 70 mM sucrose, 220 mM mannitol, 10 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 2 mM HEPES, 1 mM EGTA en 0,2%(g/v) VETZUURVRIJ BSA, pH 7,4 bij 37 °C) en aangevuld met 10 mM pyruvaat , 2 mM malaat en 4 µM FCCP, pH 7,4. Een equivalent van 10 µg eiwitten werd gezaaid op XF-96 platen (Agilent, Santa Clara, CA, USA)., Platen werden vervolgens gecentrifugeerd 2.000 g gedurende 20 minuten bij 4 °C. We visualiseerden de verdeling van mitochondriën onder een helder-veldmicroscoop om hechting en homogene verdeling te garanderen. De platen werden vóór het laden gedurende ongeveer 40 minuten op 37 °C zonder CO2 gehouden. Zuurstofverbruik (OCR) werd gemeten volgens de instructies van de fabrikant (Agilent/Seahorse Bioscience). Experimenten werden gerepliceerd in drie putten en gemiddeld voor elke experimentele toestand., In totaal werden ongeveer om de 6 minuten drie metingen van het zuurstofverbruik uitgevoerd onder basale omstandigheden en na opeenvolgende toevoeging van rotenon (2 µM), succinaat (10 mM), antimycine A (40 µM) en Tmpd (N,N,N’,N’-tetramethyl-p-fenyleendiamine)/ascorbaat (100 µM/10 mM). Succinaat werd gebruikt als elektronendonor voor complex II, rotenon als complexe I inhibitor, antimycine A als complexe III inhibitor en de ademhaling door complex IV werd gemeten gebruikend TMPD/ascorbaat.,
cytometrie met hoge gevoeligheid
vanwege hun kleine omvang werden mitochondriën gedetecteerd door cytometrie met hoge gevoeligheid, met behulp van een “small particle option” bestaande uit een forward scatter (FSC) gekoppeld aan een fotomultiplicatorbuis (PMT) gemonteerd op een BD FACS Canto II Special Order Research Product (SORP, Bd Biosciences). Mitochondriën (0,5 µg) werden gekleurd met 1 µg anti-TOMM22-Atto 488 (kloon IC9-2, Sigma-Aldrich) en 1 µM van mitotracker deep red (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gedurende 30 minuten bij 37 °C en verdund met PBS tot een eindvolume van 500 µl vóór flowcytometrieanalyse., Om het aantal mitochondriën kwantitatief te meten, gebruikten we polystyreen microsfeer met een diameter van 3 µm (Polysciences, PA, USA). 80.000 microsferen werden aan elk monster toegevoegd en 500 microsferen werden verkregen. Kiezeldeeltjes (Kisker Biotech, Steinfurt, Duitsland) werden gebruikt om de grootteschaal van 100-1.000 nm te bepalen.
mitochondriale DNA-extractie door alkalische lysis
geïsoleerde mitochondriën werden gepelleteerd bij 10.000 g, 4 °c, 10 min en geresuspendeerd in 0,8 mL mtDNA-isolatiebuffer A voor elke 3 mg mitochondriale eiwitten., Mitochondriën werden vervolgens lyzed in één volume (V: v) mtDNA isolatiebuffer B (exemporaneously-prepared. 0,2 M NaOH, 1% SDS) gedurende 3 min. op ijs, onder zacht schudden. mtDNA suspensies werden geneutraliseerd met één volume (v:v) mtDNA isolatiebuffer C (1,32 m kaliumacetaat, pH 4,8 aangepast met ijskoud azijnzuur) gedurende 5 minuten. op ijs, onder zacht schudden. Mitochondriale puin werden gepelleteerd door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 14.000 g, RT. Supernatants werden overgebracht naar verse buizen. mtDNA werd ‘ s nachts neerslag bij -20 °C met 0.,1 volume (V: v) kaliumacetaat (stamoplossing:3 M natriumacetaat, pH ingesteld op 5,2 met ijskoud azijnzuur) en 0,7 volume (V: v) absolute isopropanol. mtDNA werd vervolgens gepelleteerd op 14.000 g, driemaal gewassen met 1,5 mL 70% ethanol en geresuspendeerd in DNA resuspensiebuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0). Mitochondriale DNA-concentratie werd bepaald door spectrofotometrie (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific).
kernen isolatie uit muizenhepatocyten
kernen werden geïsoleerd uit muizenlevers met behulp van gepubliceerde methoden86., Kort, tijdens mitochondriën isolatieprotocollen, terwijl supernatants werden gebruikt voor het uitvoeren van mitochondriën isolaties, pellets van de eerste 700 g centrifugatie werden geresuspendeerd in 10 mL ijskoude kernen isolatiebuffer a (5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 250 mM Sucrose. pH 7,4) en vermalen in een voorgekoelde Glass / Teflon weefselmolen. De suspensie werd verder verstoord door drie passages door een 25 G5/8 gauge naald gevolgd door twee passages door een 27 g ½ gauge naald., De suspensie werd vervolgens gefilterd tegen een 40 µM nylon celzeef (Thermo Fisher Scientific) en gecentrifugeerd bij 600 g, 4 °C, 10 min. Pellets werden geresuspendeerd in 14 mL buffer A en gecentrifugeerd bij 600 g, 4 °c, 10 min. Pellets werden vervolgens geresuspendeerd in 9 volumes ijskoude kernenisolatiebuffer B (1 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 2,0 M sucrose. pH 7,4) en gecentrifugeerd bij 16.000 g, 4 °C, 30 min. Pellets werden geresuspendeerd in 200 µL PBS en opgeslagen bij -20 °C.,
volledige cel-en nucleaire DNA-isolatie
DNA uit 25 mg hele muizenlever of de 200 µL of geïsoleerde kernen werd geëxtraheerd met behulp van QIAmp® DNA Mini Kit (QIAgen), volgens de instructies van de fabrikant. De steekproeven werden geëlueerd in de buffer van de DNA-resuspensie.,
mitochondriaal DNA en nucleaire DNA-verrijking door qPCR
dertig nanogrammen mitochondriaal DNA, nucleair DNA of dezelfde hoeveelheid totaal DNA geëxtraheerd uit hele muizenlever met behulp van de bovengenoemde protocollen, werden versterkt in een Rotorgen Q real time qPCR-cycler (QIAgen) volgens standaardprotocollen met SSO Advanced Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) in een reactievolume van 10 µL., Two distinct primer couples were used: one specific to mitochondrial DNA (5′-GGAACAACCCTAGTCGAATGAA-3′/5′-GCTAGGGCCGCGATAATAAA-3′) and the other to nuclear DNA (5′-CCTGCTGCTTATCGTGGCTG-3′/5′-GCCAGGAGAATGAGGTGGTC-3′). The experimental conditions were: 50 °C – 2 minutes in, 95 °C – 10 min and 40 cycles (95 °C – 15 seconds, 60 °C – 1 minutes). Fold changes were calculated with the 2−ΔCt method setting mean value for total liver DNA extracts as 1.,
mitochondriale DNA-vertering door restrictie-enzymen
gezuiverde muis mtDNA werd verteerd met HAE II-of PST I-restrictie-endonucleases (NEB, Whitby, ON, Canada) volgens het Protocol van de fabrikant. Verteerde producten (1,5 µg) werden vervolgens opgelost op een 0,5% (g/v) agarose gel. Beelden werden verkregen op een Chemidoc MP gel documentatiesysteem (Bio-Rad). Gel over de gehele lengte wordt weergegeven in aanvullende Fig. 6d.,
S1 nuclease behandeling van mitochondriaal DNA en nucleair DNA
30 µg mtDNA en ndna werden verdund in 200 µL 1x S1-buffer en behandeld met 50 U S1 nuclease (Thermo Fischer Scientific) gedurende 5 minuten bij 37 °C. De reactie werd gestopt door toevoeging van 600 mM EDTA (eindconcentratie) en incubatie bij 70 °C gedurende 10 minuten. De monsters werden neergeslagen door toevoeging van 300 mM natriumacetaat (eindconcentratie) en 2 volumes (V:v) absolute ethanol gedurende 16 uur bij -20 °C., Monsters werden gepelleteerd op 14.000 g, RT, 20 minuten, en gewassen 1 mL 70% ethanol en geresuspendeerd in DNA resuspensiebuffer. Voor competitietesten volgden onbehandelde ndna en mtDNA dezelfde behandeling zonder toevoeging van het enzym. De steekproeven werden gedoseerd door qPCR.
Mitochondriënoxidatie in-vitro
gedoseerde mitochondriën werden gepelleteerd en geresuspendeerd in een concentratie van 1,5 mg mitochondriale eiwitten/mL in PBS die 500 µM van het oxidant tertbutylhydroperoxide (Tbhp) (Sigma-Aldrich) bevatten., Mitochondriën werden geoxideerd gedurende 1 uur 30 min bij 37 °C onder zacht schudden vervolgens tweemaal gespoeld met ijskoude PBS. Geoxideerde mitochondriën werden vervolgens gekwantificeerd door BCA.
mitochondriale lipidenoxidatie
thiobarbituurzuurreactieve stoffen (tbars) vorming werd beoordeeld met behulp van de Tbars Parameter Kit (R&d systems, Minneapolis, MN, USA), volgens de instructies van de fabrikant. Tweehonderd microgram mitochondriën werden gelyseerd, de eiwitten werden neergeslagen met behulp van trichloorazijnzuur (TCA) en gepelleteerd bij 12.000 g, kamertemperatuur, 4 min., De supernatants werden overgebracht naar verse buizen. Monsters (75 µL) werden geïncubeerd met 37,5 µL thiobarbituurzuur in een 96-wells-plaat gedurende 3 uur bij 50 °C. De absorptie werd afgelezen bij 532 nm op een SpectraMax 190 microplaatlezer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) en tbars werd gekwantificeerd met behulp van een standaardkromme die in de kit werd meegeleverd. Geoxideerde monsters werden vergeleken met controle mitochondria die werden geïncubeerd onder dezelfde voorwaarden in PBS verstoken van TBHP.,
mitochondriale eiwitoxidatie
de vorming van carbonyldelen na in-vitro mitochondriale oxidatie werd gemeten met behulp van de proteïne Carbonylgehalte Assay Kit (Sigma Aldrich) volgens de instructies van de fabrikant. Geoxideerde monsters werden vergeleken met controle mitochondria die werden geïncubeerd onder dezelfde voorwaarden in PBS verstoken van TBHP.,
detectie van antilichamen gericht op mitochondriale epitopen door ELISA
voor de detectie van anti-hele mitochondriale antilichamen (awma) werden muriene mitochondriën verdund (500 µg/mL) in 50 mM carbonaat / bicarbonaatbuffer, pH 9,6 en 25 µL per putje werden geladen op 96-wells half-area clear flat bottom polystyreen high-binding microplaten (Corning, New York, USA). De platen werden gedurende 18 uur bij 4 °C gecoat en vervolgens gedurende 4 uur bij 37 °C Geblokkeerd met PBS met 10% FBS en 0,5% gelatine. Na drie wasbeurten met PBS wordt sera verdund met 1: 150 (tenzij anders aangegeven) in PBS-10% FBS-0.,3% gelatine werd ‘ s nachts bij 4 °C in duplo geïncubeerd. Na drie wasbeurten met PBS werden de platen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met alkalische fosfatase-(AP) geconjugeerde geit anti-muis of anti-humaan IgG (Sigma-Aldrich) verdund 1:1.000 in PBS-0,4% bovine serum albumine (BSA). Platen werden driemaal gewassen met PBS en ontwikkeld met P-nitrofenolfosfaat (p-NPP) gedurende ~30 min bij 37 °C en optische dichtheden (OD) werden afgelezen bij 405 nm op een microplaatlezer., Hetzelfde protocol werd gebruikt voor de detectie van auto-antilichamen gericht op submitochondriale deeltjes door gebruik te maken van 25 µL per putje SMP verdund (50 µg/mL) in 50 mM carbonaat/bicarbonaatbuffer, pH 9,6. Een soortgelijke aanpak werd gebruikt voor menselijke mitochondriën met de volgende modificatie: platen werden geïncubeerd met een mierikswortelperoxidase-geconjugeerd anti-humaan IgG secundair antilichaam (1:3.000), peroxidase activiteit werd geopenbaard bij kamertemperatuur voor ~5 min met 3,3′,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB). De reactie werd gestopt met 2 N H2SO4 en de ODs gelezen bij 450 nm., Voor de anti-mtDNA ELISA werden platen vooraf gecoat met 1% protaminesulfaat in dubbel gedestilleerd water gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De platen werden driemaal gewassen met PBS en ‘ s nachts bij 4 °C bedekt met 400 ng mtDNA in PBS. Alle volgende stappen waren identiek aan die voor AwMA-Elisa ‘ s. Blanco waarden (mitochondriale antigenen en geen sera) werden afgeleid uit gemeten waarden voor elke patiënt. Tijdens de ontwikkeling van deze analyses, werd de juiste coating van de putten getest door isotype-matched muis monoclonal antilichamen (mAb) te gebruiken. Een monoklonaal antilichaam (kloon IV.,3, 4 µg/mL) werd gebruikt als een negatieve controle van de assay in elk geval, terwijl verschillende monoklonale antilichamen werden gebruikt, afhankelijk van de coating antigenen, als positieve controle van de assay: een anti-TOMM22 mAb (kloon IC9-2, 4 µg / mL. Abcam) voor intacte mitochondriën, een anti-DNA mAb (kloon 35I9 DNA, 10 µg / mL. Abcam) of een anti-cytochroom c mAb (kloon 7H8, 2C12, 5 µg / mL. Bd Biowetenschappen).,
Competition assay
AwMA-Elisa ‘ s werden uitgevoerd zoals beschreven in de vorige secties met de volgende wijzigingen: serummonsters werden vooraf geïncubeerd in verdunningsbuffer (1:150), verrijkt met verschillende concentraties (0,25, 1 en 3 mg / mL) van concurrenten (d.w.z. mitochondriën of rode bloedcellen microdeeltjes) gedurende 3 uur. bij RT en geïncubeerd in duplo ‘ s nachts bij 4 °C. De gegevens worden gepresenteerd als het percentage signaal dat overblijft na elke wedstrijd, vergeleken met de OD (405 nm) gemeten in afwezigheid van concurrenten.,
een soortgelijke procedure werd gebruikt voor AmtDNA-ELISA, waarbij gebruik werd gemaakt van verhoogde concentraties (0, 3, 9 en 27 ng/µL) van concurrerend DNA (geëxtraheerd uit kernen of mitochondriën, met of zonder behandeling met S1-nuclease).
statistieken
vergelijkingen tussen groepen werden gemaakt met behulp van Student ‘ S T-test, Wilcoxon test, Friedman of Kruskal-Wallis tests, one-way ANOVA, two-way of herhaalde metingen ANOVA afhankelijk van de uitkomst, evenals het aantal en type groepen., Wanneer meerdere vergelijkingen werden beoordeeld, werden geschikte post-hoc correctietests gebruikt, zoals die van Dunn, Dunnett, Sidak of Bonferroni. associaties tussen AwMA, AmtDNA en anti-HSP60 werden berekend met Spearman-correlaties. De verdeling van deze antilichamen volgens de ACA-resultaten werd vergeleken met behulp van de Wilcoxon-test. Associaties tussen AwMA of AmtDNA en klinische resultaten werden bestudeerd door bivariate en multivariate lineaire en logistieke regressies., Klinische resultaten bestudeerd zijn gemiddelde intima media dikte, procentuele verandering van de flow-gemedieerde dilatatie (MKZ) van de brachiale arterie, de aanwezigheid van MKZ, aanwezigheid van plaque in de halsslagader, trombotische gebeurtenis ooit, witte bloedcellen te tellen, aantal trombocyten, verhoogd DNA-binding door Farr assay boven de normale range voor het testen van het laboratorium, de aanwezigheid van schade volgens SLICC Schade-Index (SDI > 0), een hoge activiteit volgens SLEDAI-2K activity score (SLEDAI ≥ 4), aanwezigheid van lupus nefritis, biopsie klasse, evenals chronicity en activiteit van de index van de biopsie., Deze laatste werden aangepast voor de duur van de ziekte, de leeftijd, de body mass index (BMI), LDL-cholesterol (low-density lipoproteïnen), antimalariamedicatie en prednison. Logistieke regressies worden gepresenteerd met oneven ratio ‘ s en hun 95% Wald betrouwbaarheidsinterval. De resultaten van de deelnemers werden als positief beschouwd voor AwMA en AmtDNA wanneer hun waarde boven de cut-off waarde lag die werd geïdentificeerd na het maximaliseren van Youden ‘ s Index. Een 95% betrouwbaarheidsinterval werd verkregen voor de cut-off met behulp van 10.000 bootstrap monsters. Prestatiemetingen worden gepresenteerd met hun 95% exacte betrouwbaarheidsinterval.,
Software
Western blot beelden werden verkregen met behulp van Image Studio cijfers 5.2 (LI-COR biotechnologie). mtDNA migratie door agarose gel werd afgebeeld met behulp van Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad). DLS studies werden uitgevoerd met behulp van de ingebouwde Zetasizer 7.10 software (Malvern Instruments). EM beelden werden verworven met de Image Capture Software 601.384 (Advanced Microscopy Techniques Corp., Woburn, MA, USA). Cytometry de stroom werd uitgevoerd gebruikend FACSDiva™ 6.1.3 van BD (Biosciences van BD). De opbrengsten van DNA-isolaties werden gekwantificeerd gebruikend ND-1000 3.8.,1 software (Thermo Fisher Scientific) en qPCR werden uitgevoerd met RotorGene 6.1 (Corbett Research/QIAgen). Optische dichtheden werden gemeten met SoftMax Pro 5.4.1 (moleculaire apparaten). De cijfers werden samengesteld met ImageJ 1.47 (National Institutes of Health, Rockville, MA, USA) en Photoshop CS6 13.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, CA, USA). Statistische analyses werden uitgevoerd met Prism 7 software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) en SAS versie 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).