PMC (Nederlands)
discussie
Het is belangrijk om genvariaties te relateren aan klinische fenotypen met behulp van de juiste fenotyperingsinstrumenten van CYP3A4-activiteit. De 3-hydroxylering van kinine is bewezen als een biomarkerreactie voor CYP3A4-activiteit omdat 3-hydroxylering van kinine zowel in vivo als in vitro door CYP3A4 wordt gekatalyseerd (Mirghani et al., 2003; Rahmioglu et al., 2011)., Daarom werden in dit onderzoek de kinetische parameters van enzymatische katalyse op kinine-3-hydroxylering gebruikt als maat voor de CYP3A4-activiteit.
drieëntwintig van de recombinante CYP3A4-holoenzymen vertoonden een significant verlaagde CLint naar kinine toe. Zes varianten, CYP3A4*8 (R130Q), CYP3A4*12 (L373F), CYP3A4*13 (P416L), CYP3A4*17 (F189S), CYP3A4*20 (488 frameshift) en CYP3A4*21 (Y319C) vertoonden veel lagere CLint voor kinine (1,44–5,80%, Tabel 2) dan wild-type CYP3A4*1A., Als onze in vitro bevindingen in klinische studies worden herhaald, kunnen patiënten die drager zijn van deze allelen mogelijk slechte CYP3A4-metaboliseerders zijn en kunnen: i) lagere kininedoses nodig zijn om therapeutische plasmaconcentraties te bereiken; en ii) een verhoogd risico lopen op bijwerkingen en toxiciteit wanneer conventionele kininedoses worden gebruikt.
CYP3A4 * 2 (S222P) vertoonde een verminderde CLint van meer dan zesmaal (14,76%, Tabel 2) voor kinine in vergelijking met wild-type CYP3A4*1A., Deze verminderde enzymatische activiteit kan zijn omdat een serine→Proline aminozuursubstitutie een belangrijke verandering in de driedimensionale structuur van het enzym kan veroorzaken (van proline is bekend dat het Alfa-helices breekt). Ook is van CYP3A4*2 gemeld dat het een lagere CLint heeft voor midazolam (Miyazaki et al., 2008), nifedipine (Sata et al., 2000; Miyazaki et al., 2008), ibrutinib (Xu et al., 2018), en lidocaïne (Fang et al., 2017), dan die van het wild-type enzym. CYP3A4 * 2 daarentegen vertoonde een hogere CLint voor amiodaron (Yang et al., 2019)., Voor testosteron had CYP3A4*2 een verminderde intrinsieke klaring wanneer deze werd uitgedrukt met behulp van het Escherichia coli express-systeem in vitro (Miyazaki et al., 2008), maar de activiteit was vergelijkbaar met het wild-type enzym wanneer uitgedrukt in baculovirus expression system (Sata et al., 2000) (Tabel 3).
CYP3A4 * 3 (M445T) vertoonde een lagere enzymatische activiteit ten opzichte van kinine, vergeleken met het wild-type allel (Tabel 2)., Het aminozuurresidu 445 wordt gevestigd binnen het behouden heem-bindende gebied, slechts twee aminozuur C-terminals aan de absoluut behouden Cys op positie 442 in het CYP3A4 proteã ne (Sata et al., 2000); daarom, kan een verandering met445thr een ongunstig effect op heme band uitoefenen, resulterend in een wijziging in katalytische activiteit van het enzym, vooral wanneer het binden van een geschikt substraat. Maar zoals vermeld in Tabel 3 was de enzymatische activiteit van CYP3A4*3 voor de meeste geteste substraten vergelijkbaar met die van het wild-type CYP3A4., De discrepantie van de resultaten kan het gevolg zijn van verschillende heterologe expressiemethoden gebruikt, en als gevolg van verschillende substraatspecificiteit voor de variant.
CYP3A4*4 (I118V) vertoonde een lagere CLint ten opzichte van kinine, ten opzichte van het wildtype CYP3A4*1A. studies naar site-directed mutagenese suggereren dat ser119 een belangrijk aminozuur is dat betrokken is als een residu op de actieve plaats (Yano et al., 2004). Daarom is het waarschijnlijk dat de Ile118Val mutatie de bouw van de actieve plaats beïnvloedt, wat resulteert in een verminderde katalytische activiteit., Evenzo toonde een in vivo onderzoek aan dat de verhouding van de urinespiegel van 6β-hydroxycortisol/vrij cortisol bij deze heterozygote personen lager was dan die bij gezonde controlepersonen, wat wijst op een verminderde enzymatische activiteit (Hsieh et al., 2001).
zowel CYP3A4 * 8-als * 13-varianten vertoonden detecteerbare, zij het lagere, concentraties CYP3A4-holoproteïnen en hadden extreem lage katalytische activiteiten naar kinine. In tegenstelling tot onze resultaten, zijn CYP3A4*8 en *13 gerapporteerd geen detecteerbare CYP holoproteïnen te vertonen wanneer uitgedrukt in bacteriële systemen (Eiselt et al., 2001)., We speculeren dat het gebruik van bacteriële Versus insect expressiesystemen de verschillende resultaten kan verklaren. Het bacteriële expressiesysteem mist een intracellulair membraanmilieu (Gonzalez en Korzekwa, 1995) dat Voor hoge uitdrukking van proteã ne wordt vereist. In tegenstelling, kunnen de insectencellen proteã nen verwerken en wijzigen op een manier gelijkend op menselijke cellen, toestaand het juiste vouwen van het enzym en integratie van de cofactor van heme, resulterend in hogere uitdrukking van PROTEÃ nen CYP3A4.,
CYP3A4 * 11 (T363M) werd uitgedrukt in significant lagere concentraties dan wild-type CYP3A4 (Figuur 2), een bevinding die consistent is met studies met bacteriële of zoogdierexpressiesystemen (Eiselt et al., 2001; Murayama et al., 2002). Threonine bij residu 363 binnen de substraatherkenningsplaats (SRS) -5 kan bijdragen tot de vorming van het waterstofbindingsnetwerk. Een substitutie van threonine naar methionine kan resulteren in het verlies van katalytische activiteit (Murayama et al., 2002). CYP3A4 * 11 vertoonde in dit onderzoek dus een verminderde kininehydroxyleringsactiviteit., Bovendien vertoonde CYP3A4*11 een verminderde testosteronhydroxylatieactiviteit (Murayama et al., 2002), had Opmerkelijk verhoogd CLint naar lidocaïne (Fang et al., 2017) en amiodarone (Yang et al., 2019), maar werd niet geassocieerd met merkbare veranderingen in metabole activiteiten voor ibrutinib (Xu et al., 2018) (Tabel 3).
CYP3A4 * 12 (L373F) vertoonde een sterk verlaagde CLint naar kinine, vergelijkbaar met een eerder onderzoeksresultaat naar midazolam (Eiselt et al., 2001)., CYP3A4 * 12 bezit een aminozuurverandering van Leu373Phe; het gemuteerde residu bevindt zich in de buurt van Arg-372 en Glu-374, die deelnemen aan de vorming van een waterstofbindingsnetwerk en betrokken zijn bij actieve locaties volgens studies met site-directed mutagenese (Yano et al., 2004). Daarom is het waarschijnlijk dat het mutationele residu (L373F) de stabiliteit van het waterstofbindingsnetwerk en de ruimtelijke conformatie van de actieve plaatsholte beïnvloedt, wat resulteert in een gewijzigde katalytische activiteit van CYP3A4*12.,
CYP3A4 * 20 (488 frameshift) vertoonde een opmerkelijk verminderde apoproteïne expressie (figuur 1) en een dramatisch verminderde CLint richting kinine. Er zijn daarentegen geen katalytische activiteiten van midazolam 1′- en 4-hydroxylering gemeld in gist-of HEK 293-microsomen die CYP3A4*20 tot expressie brengen (Westlind-Johnsson et al., 2006). Deze tegenstrijdige resultaten kunnen worden toegeschreven aan de verschillende heterologe expressiesystemen en substraten die in de experimenten worden gebruikt. Bovendien is gemeld dat een CYP3A4*20 heterozygoot, geïdentificeerd bij Braziliaanse personen, een verminderde systemische klaring van ∼1 vertoont.,9-voudig voor midazolam in vivo (Westlind-Johnsson et al., 2006). Er werd eerder verondersteld dat deze zeldzame mutatie eiwit folding, heme incorporatie kan beïnvloeden (Westlind-Johnsson et al., 2006), en de ruimtelijke bouw van actieve-site holte, die leiden tot een vermindering of verlies van katalytische activiteit geassocieerd met het substraat gebruikt.
CYP3A4 * 21 (Y319C), die werd geïdentificeerd in de Chinese populatie (Zhou et al., 2011), vertoonde zwakke katalytische activiteit naar kinine in onze studie. Interessant, geen detecteerbare apoenzyme uitdrukking werd geïdentificeerd in onze resultaten., Tyr319 is een zeer geconserveerd residu in de cytochroom P450 familie door eukaryote evolutie van nematode aan mens (Zhou et al., 2011). Volgens In silico functionele voorspellingen (Zhou et al., 2011), ligt het Tyr319-residu op een belangrijk domein en een substitutie van Tyr door Cys op positie 319 van het CYP3A4*21-eiwit kan dramatische veranderingen in de holteconfiguratie op de actieve plaats veroorzaken. Daarom kan CYP3A4*21 een slecht functionerend eiwit produceren met een verminderde katalytische activiteit naar kinine., Bovendien speculeerden we dat deze antilichamen die we gebruikten om CYP3A4 recombinante apoproteïnen te detecteren mogelijk niet geschikt zijn om de variant CYP3A4*21 te detecteren. Dat wil zeggen, de mutatie van Tyr319Cys in CYP3A4*21 kan verhinderen dat deze antilichamen de specifieke epitopen in CYP3A4 herkennen.
daarentegen vertoonden twee van de recombinante CYP3A4-holoenzymen, CYP3A4*15 (R162Q) en CYP3A4*29 (F113I), een significant verhoogd CLint voor kinine. Evenzo vertoonden zowel CYP3A4 * 15 als CYP3A4 * 29 een verhoogde CLint ten opzichte van lidocaïne (Fang et al., 2017), maar toonde verminderde CLint voor ibrutinib (Xu et al., 2018)., CYP3A4 * 15 werd eerst gedetecteerd in verschillende etnische populaties met kleine monsters voor elke etnische groep (Lamba et al., 2002). CYP3A4 * 29 werd geïdentificeerd en benoemd in onze recente studie (Hu et al., 2017). De twee varianten zijn gerelateerd aan het snelle metabolisme van kinine in vitro. Indien bevestiging van verhoogde kinineklaring wordt gevonden bij personen die homozygote of heterozygote dragers zijn van CYP3A4*29 of CYP3A4*15, kunnen deze personen CYP3A4 ultrasnelle metaboliseerders van kinine zijn., Patiënten met deze genotypen kunnen: I) een slechtere therapeutische werkzaamheid hebben wanneer de gebruikelijke klinische doses kinine worden toegediend; en ii) hogere doses nodig hebben om therapeutische plasmaconcentraties te bereiken.
Er werden geen actieve holoenzymen van de CYP3A4*6 (277 frameshift), CYP3A4*26 (R268Stop) en CYP3A4*30 (R130Stop) varianten gedetecteerd en vertonen bijgevolg geen metabole activiteit op kinine (Tabel 2).,
CYP3A4 * 6 heeft een insertie van een adenineresidu in exon 9 (830-831 insA); deze mutatie veroorzaakt een frameshift en leidt tot de vertaling van een afgekapt eiwit dat heme niet kan bevatten (Hsieh et al., 2001). Daarom werd de katalytische activiteit van CYP3A4*6 naar kinine in onze studie niet vastgesteld. Zoals eerder in vivo werd aangetoond, bleek een Chinese persoon heterozygoot te zijn voor CYP3A4 * 6 met een veel lagere verhouding van de urinespiegel van 6β-hydroxycortisol: vrij cortisol dan wild-type individuen, wat wijst op een verminderde CYP3A4-activiteit (Hsieh et al., 2001)., Evenzo had een patiënt die heterozygoot is voor CYP3A4 * 6, die een orgaantransplantatie onderging, een tacrolimus concentratie-naar-aangepaste dosisverhouding die 4,3 maal hoger was dan die van wild-type patiënten (Jun et al., 2009).
CYP3A4 * 26 heeft een C→T nucleotide substitutie in exon 5. Dit veroorzaakt een verandering van arginine aan een voortijdig einde codon op positie 268, en resulteert in een veronderstelde verkorte proteã ne die katalytisch domein en daarom activiteit ontbreekt (Werk et al., 2014)., CYP3A4*26 kan mogelijk niet tot expressie komen als gevolg van het premature stopcodon op positie 268 of indien dit wel het geval is, kan het eiwit gemarkeerd zijn voor snelle afbraak (Werk et al., 2014). Dienovereenkomstig konden we het holoproteïne van de CYP3A4*26-variant, uitgedrukt in Sf21-cellen, niet detecteren. Evenzo vertoonde een 19-jarige niertransplanteerde patiënt, geïdentificeerd als een homozygoot voor CYP3A4 * 26 en ondertussen ook een homozygoot voor CYP3A5 * 3, een onverwacht hoge tacrolimus plasmaspiegel als gevolg van een extreem verminderde tacrolimus klaring (Werk et al., 2014).,
net als CYP3A4*26, heeft CYP3A4*30 een verandering van arginine naar een prematuur stopcodon op positie 130 (Hu et al., 2017). De Arg130 wordt beschouwd als belangrijk voor heme incorporatie (Eiselt et al., 2001) en dus zou de mutatie van Arg130 de opname van heme verstoren en zo de holoenzyme-expressie van CYP3A4 beïnvloeden.
in combinatie met eerdere studies (Tabel 3) toonden sommige CYP3A4 allelische varianten de verschillende voorkeuren voor de substraten in tegenstelling tot die van de wild-type enzymen. Namelijk, sommige varianten vertonen gewijzigde katalytische activiteiten met een substraat-afhankelijk profiel., Zoals hierboven besproken, kunnen tegenstrijdige resultaten die voortvloeien uit een specifiek substraat in studies het gevolg zijn van vele factoren, zoals discrepanties met de in vitro of in vivo methode en verschillende heterologe expressiesystemen.
kinine heeft frequente bijwerkingen vanwege de smalle therapeutische index (Bateman and Dyson, 1986). Deze bijwerkingen werden niet alleen veroorzaakt door geneesmiddelen; ze werden ook veroorzaakt door veel voorkomende kinine bevattende dranken., Op basis van een systematische beoordeling van de klinische gegevens van honderdveertien artikelen waren bijwerkingen, die het gevolg waren van kinine bevattende dranken, goed voor 20% van de totale bijwerkingen van kinine (Liles et al., 2016). Verrassend genoeg, zelfs met minieme blootstelling van gemeenschappelijke dranken, sommige individuen ervaren ernstige bijwerkingen waarbij meerdere orgaansystemen. Gezien een duidelijke interindividuele diversiteit in kininegevoeligheid, kan variatie in CYP3A4 een mogelijk mechanisme zijn dat ten grondslag ligt aan kininegevoelige en ongewenste effecten., Bovendien zijn er in sommige landen geen voorschriften voor kininegebruik vastgesteld, zoals pillen die 50 mg of minder kinine bevatten, worden beschouwd als een natuurlijk gezondheidsproduct en zijn in Canada zonder voorschrift verkrijgbaar (Liles et al., 2016); kinine-bevattende lotions en shampoos, evenals kinine-bevattende dranken, blijven algemeen beschikbaar en toezicht is niet vereist. Daarom wordt een verhoogde bewustwording van interindividuele verschillen in kininegevoeligheid en bijwerkingen van kinine bij artsen en het publiek noodzakelijk geacht.